Димер из двух молекул белка-репрессора lacI (внизу), присоединившийся к своему оператору на молекуле ДНК (изображение с сайта www.uphs.upenn.edu)
Ученые из Гарвардского университета (США) впервые сумели непосредственно пронаблюдать работу транскрипционного фактора — белка, регулирующего активность генов. Чтобы найти свой оператор — то место на хромосоме, к которому он должен прикрепиться, — белок LacI подходит к молекуле ДНК в произвольном месте и скользит вдоль нее не более 5 миллисекунд. Если оператор не найден, белок отделяется от ДНК, недолго блуждает по цитоплазме, снова присоединяется к хромосоме в другом месте и продолжает поиск, который в общей сложности занимает до 5-6 минут.
Транскрипционные факторы (ТФ) — это специализированные белки, регулирующие считывание генов (транскрипцию). ТФ имеются у представителей всех царств живой природы. Они распознают короткие (длиной примерно 10-20 нуклеотидов) участки ДНК — так называемые регуляторные элементы, или сайты связывания ТФ (TF binding sites) — и прикрепляются к ним. Сайты связывания ТФ обычно располагаются перед началом регулируемого гена. Это либо способствует, либо, наоборот, препятствует работе ДНК-зависимой РНК-полимеразы — фермента, осуществляющего транскрипцию. В соответствии с этим ТФ делятся на индукторы (активаторы) и репрессоры.
До сих пор было не совсем понятно, каким образом ТФ находит свой сайт. Большинство молекулярных процессов в клетке основано на взаимном узнавании молекул, подходящих друг к другу «как ключ к замку». Обычно для того, чтобы нужные молекулы нашли друг друга, достаточно хаотических процессов — диффузии и броуновского движения. Чтобы можно было всерьез рассчитывать на случайную встречу фермента (например, алкоголь-дегидрогеназы) и его лиганда (например, этилового спирта), этих молекул в клетке должно быть достаточно много.
Но транскрипционные факторы — товар штучный. Обычно клетка синтезирует лишь по несколько молекул каждого ТФ. В еще большей степени это относится к их «лигандам», то есть сайтам связывания. Во многих случаях в геноме есть только одно-единственное место, к которому данный ТФ может прикрепиться. Как ТФ находит его среди миллионов нуклеотидов?
До сих пор ответ на этот вопрос можно было искать лишь на основе косвенных данных. В последнем номере журнала Science специалисты из Гарвардского университета сообщили о первом прямом наблюдении за деятельностью транскрипционного фактора в живой клетке. Ученые использовали классический объект — кишечную палочку E.coli и ее вдоль и поперек изученный lac-оперон (опероном называют группу из нескольких соседних генов, регулируемых и транскрибируемых совместно и обычно участвующих в выполнении какой-то общей функции).
|
lac-оперон (см. рис.) состоит из трех генов, необходимых для усвоения лактозы. Непосредственно перед опероном располагается ген транскрипционного фактора — репрессора lacI. Когда в клетке нет лактозы, lacI прикрепляется к своему сайту (оператору О1), тем самым блокируя транскрипцию lac-оперона. Когда в клетке появляется лактоза, ее производное (аллолактоза) присоединяется к белку lacI. В результате белок меняет свою конформацию и отсоединяется от оператора. Это позволяет РНК-полимеразе приступить к прочтению lac-оперона, и клетка начинает производить ферменты, требующиеся для утилизации лактозы.
Исследователи изготовили генно-модифицированную кишечную палочку, присоединив к гену lacI ген желтого флуоресцирующего белка venus. Химерный белок, синтезируемый на основе измененного гена, сохранил свои регуляторные свойства, но стал светящимся, что позволило наблюдать за ним под микроскопом.
Оказалось, что, фотографируя бактерий с большой выдержкой (1 секунда), можно отличить свободно плавающий в цитоплазме белок от прикрепившегося к своему сайту на хромосоме. В первом случае белок быстро перемещается по клетке, свет от него поступает из разных точек и как бы «размазывается» по цитоплазме. Во втором становится видна яркая точка, поскольку молекула ДНК, к которой прикрепляется ТФ, относительно неподвижна. В каждой клетке таких точек может быть одна или две, в зависимости от того, в какой стадии жизненного цикла находится клетка. Оператор О1 в геноме всего один, но в ходе подготовки клетки к делению хромосома реплицируется (удваивается), и если lac-оперон уже реплицирован, то в клетке оказывается сразу два оператора О1, к каждому из которых может прикрепиться транскрипционный фактор.
|
При добавлении в среду лактозы или ее «заменителя» (изопропил в-D-1-тиогалактопиранозида, IPTG) светящиеся точки, как и следовало ожидать, быстро исчезали. При последующем разбавлении среды, ведущем к резкому снижению концентрации IPTG, точки через некоторое время появлялись вновь.
Выяснилось, что одной молекуле lacI требуется самое большее 354 секунды, чтобы найти на хромосоме свой оператор. Поскольку в реальных клетках белок-репрессор присутствует не в одном, а в нескольких экземплярах, то в действительности отключение lac-оперона происходит значительно быстрее.
Чтобы понять, каким образом lacI ищет свой оператор, исследователи фотографировали клетки с разным временем выдержки. Они исходили из общепринятой гипотезы, согласно которой ТФ должен сначала связаться с ДНК неспецифически, то есть в произвольном месте, а затем «ползать» вдоль ДНК, пока не наткнется на свой сайт (такое ползание называется «одномерной диффузией», 1-D diffusion). Эта гипотеза полностью подтвердилась. Анализируя снимки, сделанные с разной выдержкой (вплоть до 1 миллисекунды), ученые обнаружили, что молекулы lacI, не закрепленные на своих сайтах, могут находиться в одном из двух состояний, соответствующих одномерной и трехмерной диффузии. В первом случае они движутся примерно на порядок медленнее.
Выяснилось, что в процессе поиска своего сайта lacI около 87% времени проводит, будучи неспецифически связанным с ДНК и ползая вдоль нее (одномерная диффузия). Остальное время уходит на свободное перемещение по цитоплазме (трехмерная диффузия). Каждый сеанс ползания занимает не более 5 миллисекунд. За это время ТФ успевает «просмотреть» не более 85 нуклеотидов. Размер генома кишечной палочки — около 5 млн нуклеотидов, поэтому в целом на поиск уходит несколько минут.
Ясно, что у высших организмов, таких как млекопитающие, геном которых примерно в 1000 раз больше, чем у кишечной палочки, технология поиска транскрипционными факторами своих сайтов должна быть как-то оптимизирована, иначе на этот поиск уходили бы многие часы и даже сутки.
Источник: Johan Elf, Gene-Wei Li, X. Sunney Xie. Probing Transcription Factor Dynamics at the Single-Molecule Level in a Living Cell // Science. 2007. V. 316. P. 1191–1194
