Разнообразия много не бывает: чем занимаются мобильные элементы генома в мозге

	Разнообразия много не бывает: чем занимаются мобильные элементы генома в мозге Статья на конкурс «био/мол/текст»: В то время как активность мобильных генетических элементов в половых клетках давно исследуется и заслуженно считается одним из двигателей эволюции, аналогичные процессы в соматических тканях долго оставались в тени. Большой неожиданностью стали экспериментальные данные об активности мобильных элементов — ретротранспозонов — в мозге человека и мыши. Эти факты дали основания для ряда интересных гипотез об участии ретротранспозонов в обеспечении работы мозга, в возникновении патологий нервной системы и о возможной адаптивной роли этих процессов в эволюции.
Ученые-нейробилоги сконструировали специальную кольцевую ДНК-плазмиду, которая содержит ретротранспозон L1. В его нуклеотидную последовательность особым образом встроен ген зеленого флуоресцентного белка. Клетка, в которую ввели такую плазмиду, начинает испускать зеленый флуоресцентный свет, только если ретротранспозон, содержащийся в плазмиде, прошел полный цикл самовоспроизведения: был скопирован и встроен в новый участок генома. Эта технология позволяет увидеть глазами клетки, в которых активны мобильные элементы генома, не только в культуре клеток в чашке Петри, но и в мозге живой мыши.Картинка из [5].
Эта работа заняла первое место в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса «био/мол/текст»-2012. Спонсор конкурса — дальновидная компанияLife Technologies. Индивидуальный опыт и заложенная генетическая программа — как они влияют на наше поведение, характер, умственные способности, внимание, память? Над этим вопросом ломали голову все, от биологов и психологов до молодых родителей, а посвященные ему научные работы легко займут небольшую библиотеку. И все же даже на этом натоптанном поле осталось место для новых открытий. По общепринятому мнению все нервные клетки несут одинаковую генетическую информацию, а изменения в работе мозга и поведении определяются изменениями экспрессии определенных генов, что приводит к укреплению или ослабеванию связей между нервными клетками, которых в нашем мозге непредставимое множество — 100 миллиардов. Однако американские нейробиологи Фред Гейдж и Элиссон Муотри вот уже несколько лет говорят о существовании новых механизмов, регулирующих не только экспрессию генов и уровень тех или иных белков в нервных клетках, но меняющих последовательность ДНК в каждой отдельной клетке. Эти предполагаемые механизмы связаны с работой мобильных генетических элементов — так называемых «прыгающих генов». Они представляют собой либо участки ДНК, способные сами себя «копировать и вставить» в ДНК в новом месте — ретротраспозоны, — либо фрагменты, которые могут быть «вырезаны и вставлены»  — ДНК-транспозоны. Рисунок 1. Интеграция ретротранспозона L1 в геном [6]. С ретроэлемента копируется его РНК, которая затем транспортируется из клеточного ядра в цитоплазму; там на ней происходит синтез белков, которые кодирует элемент L1 — это белки ORF1 и ORF2. Затем оба белка связываются со своей мРНК и формируют таким образом рибонуклеопротеин, который транспортируется обратно из цитоплазмы в ядро. Там путем обратной транскрипции мРНК ретроэлемент L1 встраивается в новый участок генома. Образуется однонитевой разрыв на участке ДНК-мишени (а), начинается обратная транскрипция ДНК (зеленая нить) с РНК (красная нить) (b), образуется разрыв на второй нити ДНК (с) и инициируется синтез второй цепи ДНК (зеленая нить) (d), вследствие всего этого происходит дупликация участка ДНК, где происходило встраивание элемента L1 (e). Предметом исследований группы Гейджа стал наиболее распространенный тип ретроэлементов — так называемый «длинный диспергированный повтор» LINE-1* (long interspersed element, сокращенно L1); он составляет около 17% генома человека и способен к автономному самовоспроизведению. Для копирования ретротранспозоны используют механизм обратной транскрипции — на матрице ДНК синтезируется РНК, которая сама используется как матрица для создания ДНК, которая затем интегрируется в геном. В отличие от других неавтономных типов ретроэлементов (Alu- и SVA-повторы) ДНК-последовательность L1 кодирует белки, необходимые для полного цикла самовоспроизведения. Человеческий геном содержит более 500 000 копий L1, из них полноценны и способны к самовоспроизведению не более сотни, а у мышей таких полноценных копий три тысячи. * — «Биомолекула» уже писала про «жизнь» и структурную организацию ретротранспозона LINE-1: «Тайны „молекулярных паразитов“, или Как путешествовать по геному». — Ред. Мобильные элементы могут существенно влиять на работу генов, расположенных в месте их встраивания (усиливать или, что случается гораздо чаще, нарушать их экспрессию) и, таким образом, на жизнь всей клетки. Так, вследствие встраивания ретроэлементов в участки генов, кодирующих белки, могут возникать мутации, нарушающие их экспрессию. Ретроэлементы участвуют в образовании двунитевых разрывов ДНК, могут провоцировать делеции, дупликации, инверсии последовательностей ДНК и прочие генетические безобразия, а кроме того, они могут встраиваться в регуляторные участки генов и влиять на их экспрессию, не меняя кодирующую белок последовательность. Первым интересным фактом относительно активности L1 в мозге стал результат анализа транскриптома культуры стволовых клеток из мозга взрослых крыс: оказалось, что при дифференцировке нервных стволовых клеток в мультипотентные клетки-предшественники нейронов экспрессия L1 повышается в 1,5–2 раза. Это дало повод предполагать, что активность L1 может принимать участие в развитии нервной системы. Рисунок 2. «Соматическая мозаичность» клеток мозга, вызванная активностью L1 [1]. Вопреки принятому ранее мнению, что ретротранспозоны активны преимущественно в половых клетках, стало ясно, что ретроэлементы L1 экспрессируются в соматических тканях, в том числе в мозге. По последним данным, ретротранспозиции в большом количестве происходят в соматических клетках эмбриона (показано красными стрелками). Самокопирование ретроэлементов, произошедшее в мозге во время эмбрионального развития, может быть впоследствии обнаружено в различных областях мозга в группах клеток, имевших общего предшественника. Во взрослом мозге ретротранспозиции происходят только в нейрогенных областях, где рождаются новые клетки, а именно в зубчатой извилине гиппокампа (Dentategyrus). Вызванная активностью L1 «соматическая мозаичность» может способствовать повышению разнообразия среди клеток мозга, что может приводить к большему разнообразию в поведении организма в целом и способствовать его лучшей адаптации к окружающей среде. Взаимодействие организма с окружающей средой может в свою очередь влиять на интенсивность ретротранспозиций в мозге посредством еще до конца не ясных гормональных и эпигенетических механизмов. Дальнейшие исследования показали, что ретроэлементы L1, по всей видимости, активизируются на ранних этапах эмбрионального развития нервной системы, однако эта активность поддерживается и в зрелом возрасте в определенных областях мозга, где образуются новые нервные клетки (нейрогенез; подробности далее). В двух растущих по соседству нервных клетках такая «мобилизация» L1, по-видимому, происходит независимо, и в конечном итоге эти уже дифференцированные нейроны содержат новые копии L1, которые в разных клетках попали в разные участки генома и, в зависимости от этого, могут по-разному изменять профиль экспрессии генов. Этот процесс приводит к так называемой «соматической мозаичности» нервной ткани. Для наблюдения отдельных эпизодов ретротранспозиции в культурах клеток была создана специальная плазмида-индикатор активности L1, содержащая ген зеленого флуоресцентного белка*, который вырабатывался клетками (и потому эти клетки светились зеленым) только когда элемент L1 был успешно скопирован в новый участок генома. Нуклеотидная последовательность гена зеленого белка в плазмиде была записана «в обратную сторону» и прервана интроном (некодирующим участком ДНК, который вырезается из РНК после ее считывания с ДНК). Эти и другие более мелкие ухищрения были необходимы для того, чтобы зеленый белок синтезировался только с тех трансгенных элементов L1, которые претерпели обратную транскрипцию и встроились в ДНК. * — Зеленый флуоресцентный белок обрел широчайшее применение в биологии и биотехнологиях. За его открытие и внедрение в практику в 2008 году вручена Нобелевская премия: «Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии». — Ред. Исследователи вводили такую плазмиду в культуру стволовых клеток из мозга взрослой крысы и в культуру эмбриональных стволовых клеток мозга человека, а затем наблюдали, что происходит при их дифференцировке в мультипотентные нервные клетки-предшественнники, которые дают начало нейронам и двум типам глии. Оказалось, что ретротранспозиции L1 происходят в культурах с низкой, но регистрируемой частотой (в культуре стволовых клеток мозга человека 8–12 случаев на 100 000 клеток; в культуре лимфоцитов активность L1 была практически нулевой), а через 48 часов после начала клеточной дифференцировки активность L1 значительно повышалась, и в итоге у нервных клеток-предшественников, выросших из эмбриональных стволовых клеток мозга человека, могла оказаться в 25 раз выше, чем в первоначальной культуре. Эти данные удивительны по двум причинам: во-первых активность L1 в нервных клетках-предшественниках нарушает устоявшуюся догму о неизменности генома нервных клеток. А во-вторых, ранее считалось, что такая активность L1 приурочена только к клеткам зародышевого пути; активность ретроэлементов в соматических тканях, а особенно в мозге, была огромной неожиданностью. Как детектировать активность «прыгающих генов» не в культуре клеток, а в мозге живой мыши in vivo? Для этого была создана специальная трансгенная линия мышей, у которой любая клетка организма начинала испускать зеленый флуоресцентный сигнал, если в ее геноме происходила новая вставка L1. Эта система работала по такому же принципу, что и плазмида-индикатор, вживляемая в культуры клеток в более ранних опытах: последовательность гена зеленого белка была «записана» в обратную сторону и прервана интроном. У таких мышей светящиеся зеленые клетки были видны только в половых клетках и в некоторых отделах мозга, в том числе в гиппокампе. Гиппокамп (в переводе — «морской конек») — область мозга, необходимая для когнитивных процессов и особенно для формирования памяти, а кроме того, это одна из двух областей мозга, где во взрослом возрасте у людей и млекопитающих еще происходит нейрогенез — рождение новых клеток. Именно эти новые клетки-предшественники были окрашены зеленым — а значит, в них происходили ретротранспозиции. Сейчас уже имеются данные о том, что для ретротранспозиций необходим процесс клеточного деления, а генерация новых клеток не происходит в мозге взрослого человека и взрослой мыши нигде, кроме небольших нейрогенных областей — поэтому основная активность ретроэлементов приходится на эмбриональное развитие мозга, когда еще происходит клеточная пролиферация. В нервной системе мышиного эмбриона после 10 дня эмбрионального развития (всего их 21) уже были видны клетки, содержащие зеленый флуоресцентный белок, а значит, претерпевшие ретротранспозиции L1. У людей активность L1 была оценена косвенно при сравнении количества копий L1 в образцах разных тканей. В среднем клеточные ядра из образцов мозга содержали больше копий L1, чем ядра клеток сердца и печени; наиболее явными отличия были в гиппокампе и мозжечке. По оценкам в этих областях мозга нервные клетки взрослого человека претерпевают в среднем 80 «дополнительных» интеграций L1 по сравнению с клетками печени и сердца. Анализ этих данных значительно усложняла существенная вариабельность в количестве L1 не только в разных областях мозга, но и между разными индивидуумами. Насколько случайна интеграция L1 в новые участки генома нервных клеток? В экспериментах с введением флуоресцентно меченого L1 в культуру стволовых клеток мозга крыс и человека большинство ретроэлементов встраивались в участки генов, активно работающих в нейронах. В одном случае это был ген белка постсинаптической плотности Psd-93, и его работа была нарушена, в другом — ген, кодирующий переносчик нейромедиатора таурина, в третьем — ген одного из белков обонятельных рецепторов. Всего было клонировано и секвенировано не очень большое число таких интеграций L1, и вопрос о его «предпочтениях», генах-мишенях и механизмах этих процессов остается открытым. Сейчас уже стало ясно, что активность L1 может иметь негативные и даже драматические последствия для клетки и организма в целом. Примером тому — 65 известных случаев наследственных заболеваний, вызванных активностью ретроэлементов L1, SVA и Alu в клетках зародышевой линии; список включает в себя гемофилию, кистозный фиброз, синдром Аперта, мышечную дистрофию Дюшена, рак молочной железы и пр. Возникает вопрос, могут ли интеграции L1 в соматических тканях, в нервных клетках участвовать в развитии неврологических и психических патологий? Как наш организм может препятствовать непредсказуемым генетическим прыжкам? Рисунок 3. Результаты сравнительного анализа относительного количества копий L1 в мозге, сердце и печени человека [5]. В двух отделах мозга — гиппокампе и мозжечке — число копий L1 было наибольшим (В: обозначены Hi и С), тогда как в сердце и печени их число было достоверно меньше (В: обозначены Н и L). Мощные механизмы, подавляющие активность ретроэлементов в геноме человека, работают уже многие миллионы лет. Так, в самой нуклеотидной последовательности L1 заложены несколько регуляторных элементов, воздействуя на которые можно существенно подавлять его активность и транскрипцию. Здесь работает и одно из серьезнейших и универсальных орудий подавления экспрессии генов — метилирование ДНК. Было показано, что метилирование промотора L1 подавляет его активность, а мутации гена MeCP2 (нарушающие работу белка МеСР2 — транскрипционного репрессора, который связывается с метилированными участками ДНК и подавляет экспрессию находящихся там генов), стимулируют ретротранспозиции L1 в мозге. Аналогичное нарушение работы этого гена у человека может провоцировать психоневрологическое наследственное заболевание — синдром Ретта. Оно встречается почти исключительно у девочек и является следующей по частоте после синдрома Дауна специфической причиной тяжёлой умственной отсталости у девочек. Исследователи предполагают, что ретроэлементы могут участвовать в проявлении эффектов мутаций MeCP2 при этой патологии, однако каким именно образом, еще неясно. Ввиду того, что последствия активности L1 непредсказуемы, возникает вопрос, почему эти элементы генома не были элиминированы в процессе эволюции? Деятельность ретроэлементов в клетках зародышевой линии по праву считается одним из двигателей эволюции человека ввиду их массовости и высокой активности в течение последних нескольких десятков миллионов лет. По приблизительным оценкам, 0,3% всех мутаций у людей обусловлены активностью ретроэлементов, а в клетках зародышевой линии частота ретротранспозиций L1 оценивается, по разным данным, в одну вставку на 20–200 рождений. По мнению Гейджа и Муотри, высокая активность L1 в мозге хоть и не наследуется, но способствует генерации большего количества генетически и функционально разнообразных нервных клеток у каждого отдельного индивидуума. Это может приводить к проявлению более широкого спектра когнитивных способностей и давать больше возможностей для адаптации к новым условиям среды. Широкую почву для спекуляций на этой почве дают данные о том, что наиболее активная в настоящее время линия L1 человека возникла около 2,7 млн. лет назад после отделения двуногих людей от шимпанзе, когда наши общие предки-гоминиды впервые начали использовать каменные орудия. И таким образом, ретроэлементы типа L1 могли оказаться одним из факторов, способствовавших появлению вида Homo sapiens. Литература Singer T., McConnell M.J., Marchetto M.C., Coufal N.G., Gage F.H. (2010). LINE-1 retrotransposons: mediators of somatic variation in neuronal genomes? Trends Neurosci. 33, 345–354; Gage F.H., Muotri A.R. (2012). What makes each brain unique. Sci. Am. 306, 26–31; Muotri A.R., Marchetto M.C., Coufal N.G., Oefner R., Yeo G., Nakashima K., Gage F.H. (2010). L1 retrotransposition in neurons is modulated by MeCP2. Nature 468, 443–446; Muotri A.R., Chu V.T., Marchetto M.C., Deng W., Moran J.V., Gage F.H. (2005). Somatic mosaicism in neuronal precursor cells mediated by L1 retrotransposition. Nature 435, 903–910; Coufal N.G., Garcia-Perez J.L., Peng G.E., Yeo G.W., Mu Y., Lovci M.T., Morell M., O’Shea K.S., Moran J.V., Gage F.H. (2009).L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature 460, 1127–1131; Cordaux R., Batzer M.A. (2009). The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nat. Rev. Genet. 10, 691–703. Автор: Комиссарова Наталья. http://biomolecula.ru/content/1134