О флуоресцентных молекулах, взаимодействии клеточной мембраны с внешней средой и измерении силы в несколько пиконьютонов
Схема сенсора на основе ДНК и два его положения: погашенное — слева, светящееся — справа. Рисунок из обсуждаемой статьи.
Флуоресценция по краям клетки от зондов в растянутом положении. Рисунок из обсуждаемой статьи.
24 октября 2014 на сайте журнала Nature Communications была опубликована статья с описанием способа измерения силы, с которой клетка прикрепляется к поверхности. Мы попросили прокомментировать это исследование доктора биологических наук Ивана Воробьева.
Как известно, клетки многоклеточного организма тесно взаимодействуют друг с другом, а также с межклеточным веществом — матриксом (например, коллагеном). При взаимодействии клетки прикрепляются к поверхности и, если поверхность привлекательна для них (адгезивная поверхность), стремятся распластаться по ней, образуя так называемые фокальные контакты. Фокальные контакты, на поверхности которых концентрируются специальные мембранные белки — интегрины, также выполняют роль механохимического сенсора, передавая сигнал от поверхности прикрепляющейся клетки внутрь.
Одним из старых вопросов клеточной биологии является вопрос о том, какое усилие развивают клетки, когда прикрепляются к субстрату, и какими молекулярными механизмами обеспечивается их прочное прикрепление. Основные участники клеточного контакта — белки интегрины, которые располагаются в клеточной мембране и взаимодействуют, с одной стороны, с субстратом, а с другой стороны, с цитоскелетом в цитоплазме. Силы, развиваемые отдельными фокальными контактами, весьма велики, они примерно в тысячу раз больше, чем сила взаимодействия одной интегриновой молекулы. Однако измерить эти силы — задача очень сложная. Обычно она решалась путем помещения клеток на упругий субстрат, где сила рассчитывалась по деформации последнего. Такой метод имеет существенные ограничения, так как, во-первых, сила может меняться с изменением формы клетки, во-вторых, он не позволяет измерить усилие, развиваемое отдельным контактом, а дает лишь интегральную картину.
Авторы обсуждаемой статьи разработали очень остроумный молекулярный зонд, позволяющий измерять силу натяжения, которую развивают клетки, прикрепляющиеся к субстрату, при минимальных деформациях последнего. Этот зонд основан на молекулярной «шпильке», состоящей из двойной спирали ДНК, которая может быть скручена (исходное состояние) или развернута при приложении достаточного усилия. К шпильке из ДНК прикреплены еще два элемента: якорь, которым шпилька закрепляется на субстрате, и короткий пептид, который непосредственно взаимодействует с молекулой интегрина. Если взять отрезок однонитевой ДНК строго определенной длины, а в нем определенные соотношения нуклеотидных пар, образующих «шпильку» (А-Т — аденин-тимин и Г-Ц — гуанин-цитозин), то усилие, которое необходимо приложить к концам молекулы, чтобы развернуть шпильку, можно теоретически рассчитать с высокой точностью. Таким образом, если клетки будут прикрепляться к субстрату, густо покрытому зондами, содержащими свернутые шпильки ДНК, которые будут взаимодействовать с интегринами, то усилие, создаваемое распластывающимися клетками, можно будет измерить по количеству разворачивающихся зондов.
Схема сенсора на основе ДНК и два его положения: погашенное — слева, светящееся — справа. Рисунок из обсуждаемой статьи.
Следующий вопрос: как нам узнать, глядя в микроскоп на распластывающиеся клетки, что наши зонды в определенных местах развернулись? Для этого используется явление ферстеровского переноса. Ферстеровский перенос — это процесс, когда одна флуоресцирующая молекула поглощает квант света, но не высвечивает квант флуоресценции, а передает его энергию близко расположенной другой флуоресцирующей молекуле. В результате такой последовательности событий высвечивается либо квант света с длиной волны большей, чем у исходной молекулы, либо вообще высвечивания в видимой области спектра не происходит. Соответственно, если пару молекул, между которыми происходит перенос, отодвинуть друг от друга, то восстановится свечение (флуоресценция) исходной молекулы. Таким образом, по наличию флуоресценции и по ее спектру мы можем cудить о том, находятся ли две молекулы вплотную друг к другу или нет. Этот эффект был использован таким образом: к двум концам молекулы ДНК прикреплены две флуоресцирующие молекулы, между которыми возможен ферстеровский перенос. В свернутом виде молекула ДНК держит две молекулы рядом, и такая пара не флуоресцирует в видимом свете, а при разворачивании ДНК молекулы расходятся, и зонд начинает испускать свет, соответствующий спектру флуоресценции первой молекулы. «Небольшие» технические трудности, состоявшие в том, как подобрать наиболее эффективные пары красителей и как собрать полноценный зонд, который должен быть прикреплен к субстрату и достаточно прочно связываться с молекулами интегринов на клеточной поверхности, были авторами преодолены стандартным методом проб и ошибок. Поскольку зонды сидят на поверхности субстрата с большой плотностью (400 молекул на квадратный микрон), то по яркости флуоресценции, наблюдаемой в микроскоп, можно сказать, какая часть зондов и в какой области оказалась в развернутом состоянии.
Флуоресценция по краям клетки от зондов в растянутом положении. Рисунок из обсуждаемой статьи.
Таким образом, стало возможным измерять усилие, развиваемое в местах отдельных контактов, которые образует клетка с поверхностью, в диапазоне 1–20 пиконьютонов (то есть 10-11–10-12 Н). Оказалось, что высаженные на субстрат фибробласты в течение 3–4 минут развивают значительное усилие по своему наружному краю, разворачивая до 9% шпилек. Эти усилия развиваются на небольших участках так называемых фокальных контактов и возникают только тогда, когда в данной области клетки появляются молекулы интегринов. Сила натяжения обеспечивается цитоскелетными белками, которые взаимодействуют с контактами изнутри. К сожалению, дальше начались проблемы. Когда авторы решили измерить усилия более точно, используя одновременно два типа зондов, содержащих разные шпильки ДНК (содержащие только ГЦ-пары или в основном АТ-пары), то оказалось, что интегрины на краю клеток иногда с большей охотой сначала разворачивают в три раза более прочные ГЦ-шпильки, а лишь затем менее прочные. Хотя таких «парадоксальных» контактов не очень много, но они значительно усложняют интерпретацию данных. И надо отметить, что авторы не поленились провести такой скрупулезный анализ и добросовестно описали возникшую проблему. Таким образом, как это часто бывает в экспериментальной биологии, в измерения силы вмешались дополнительные факторы, которые пока не позволяют однозначно оценить привлекательность данного инструмента для полноценных количественных исследований. Приходится ограничиваться proof-of-principle, то есть метод вообще-то работает, но насколько адекватно он измеряет все силы, развиваемые прикрепляющейся клеткой, еще предстоит выяснить независимыми способами. Так что основным достижением работы является рецепт по изготовлению относительно недорогих и ярких зондов на основе шпилек ДНК, которые позволят измерять усилия в диапазоне нескольких пиконьютонов с хорошим пространственным разрешением. Такие зонды, вероятно, будут востребованы в различных исследованиях, связанных с взаимодействием клеточных структур.
