| Ингибируй, властвуй, понижай
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Как ни заглянешь в лабораторию биофизики на Школе молекулярной и теоретической биологиив Пущино — удивишься: вот ребята режут свёклу, вот измельчают репку на тёрке, вот сотрудники рисуют на доске куски пиццы... Темноволосый старшеклассник в фартуке достаёт прихваткой контейнер из микроволновки. Нет, он не записался на кулинарные курсы. Он окрашивает белки в геле после электрофореза.
| |
Обратите внимание!
Эта работа представлена на конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014 в номинации «Своя работа».
Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики. Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon. Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.
Слизни, насекомые и прочие «поедатели» растений, а также патогенные микроорганизмы расщепляют белки своих молчаливых жертв с помощью особой группы ферментов — сериновых протеиназ(в частности, к ним относится трипсин). Но в эволюционных войнах не выигрывает тот, кто ничего не изобретает, и растения выработали различные механизмы защиты. Дать отпор врагам на биохимическом уровне помогают ингибиторыразличных протеиназ, в том числе и сериновых, которые мешают консументам
Учёные постоянно ищут новые ингибиторы сериновых протеиназ в культурных растениях. Уже известны ингибиторы трипсина, выделенные из кукурузы, сои, гороха, картофеля и других овощных культур, однако малоизвестные за рубежом, но такие традиционные для России репа и свёкла до недавних пор не были исследованы на предмет наличия таких белков. А что, если (и это даже вполне вероятно) ингибиторы из этих корнеплодов даже лучше справятся с некоторыми задачами, чем их известные аналоги?
Девица в темнице, коса на улице
Цели? Мы что, борцы за права растений и хотим помочь им не быть съеденными? — И это тоже. Защищать сельскохозяйственные культуры от вредителей, подавляя активность ферментов последних — интересная идея, но не единственный способ использования найденных веществ. В силу собственной эгоистичности человек, конечно, в первую очередь будет искать вещества, регулирующие различные функции его организма (и в данном случае не промахнётся): сериновые протеиназы участвуют в таких важных процессах, как пищеварение (что неудивительно — мы и начинали с разговора о расщеплении растительных белков), свёртывание крови, иммунный ответ и даже размножение. Некоторые ингибиторы протеиназ уже нашли применение в медицине — как препарат Инвираза® (сакнавир), используемый для лечения ВИЧ-инфекции и удостоенный премии Галена (одной из высочайших наград, присуждаемых за создание лекарственных препаратов). Представляете, какие возможности могут скрывать под землёй такие обыденные, привычные корнеплоды?
Школа молекулярной и теоретической биологии в Пущино (ШМТБ)
ШМТБ, организованная Фондом Дмитрия Зимина «Династия» при поддержке Медицинского института имени Говарда Хьюза (The Howard Hughes Medical Institute), MIT-Russia и барселонского Центра геномной регуляции (The Centre for Genomic Regulation), уже в третий раз стала местом концентрации юных биологических умов: если помните, мы уже писали о ней в статье «НИИ ЧАВО себе!» [1]. Вот что можно прочесть о ней на официальном сайте Фонда: «Концепция нашей школы основана на убеждении, что многие старшеклассники готовы к участию в научных экспериментах — как интеллектуально, так и практически. Мы считаем, что опыт работы в научной среде, в настоящих лабораториях будет полезен для тех старшеклассников, которые должны решить, хотят ли они заниматься наукой и подходит ли им этот род деятельности. Школа даёт им шанс поработать над настоящими научными задачами бок о бок с настоящими учёными и — возможно — внести вклад в исследования научной лаборатории».
В этом году проект вышел на международный уровень: кроме талантливых ребят со всех концов России и нескольких заграничных заведующих лабораториями, как раньше, в нём приняла участие делегация каталонских школьников и профессоров. Чтобы иностранные гости полноценно интегрировались в процесс работы, а русскоязычные могли «подтянуть» свой уровень, лекции, курсы (в числе которых, кстати, был курс обсуждения прозы Борхеса), выполнение проектов в лаборатории и даже общение в свободное от занятий время проходили на двух языках: русском и английском.
Типы ингибирования на примере Pac-Man («олицетворяет» фермент) и пиццы (субстрат/ингибитор). При конкурентном типе ингибирования Pac-Man ест пиццу-ингибитор. Она у него «во рту», заткнула активный центр, но через некоторое время он может её «выплюнуть», если увидит кусок получше. При неконкурентном ингибировании пицца не съедается, а ударяет Pac-Man-а так, что тот уже не может есть новую пиццу.
Ешь свёклу — и тромбов не будет?
К тому же классу ферментов — сериновым протеиназам — относится и тромбин, который в каскаде свёртывания «отрезает хвостики» молекулы фибриногена (подробнее об этом можно прочитать в статье«Как работает свертывание крови?» [2]). Таким образом он «распаковывает» мономеры фибрина — кирпичики, из которых строится «каркас» кровяного сгустка, укрепляя наскоро собранную «дамбу» из тромбоцитов. К этому каркасу вскоре прилипают клетки крови, формируя сначала белый, а потом и красный тромб. Работа этой системы помогает нам избежать риска смерти от потери крови после каждой царапины (у людей с гемофилией даже самый маленький синяк превращается в огромную гематому). Одним из сигналов, запускающих каскад реакций свёртывания, является белок тканевый фактор (как нетрудно догадаться, попадающий в кровь из повреждённых тканей). Реакции идут на отрицательно заряженных поверхностях, сформированных обрывками повреждённых клеток.
Схема механизма сворачивания крови. Картинка с сайта Vmede.org.
Однако отрицательный заряд формируется в ответ ещё и на различные металлические протезы или сердечные клапаны. Что же получается? Белки-активаторы, как дозорные, следящие за общим состоянием крови, решают, что крепостная стена — стенка кровеносного сосуда — разрушена, и через нескольких промежуточных «гонцов» передают экстренное послание тромбину. Тромбин, конечно, бросает все силы на распаковку кирпичей и строительство баррикад. Тромбоциты, сформировавшие так называемый белый тромб в течение
Учёные разрабатывают методы борьбы с тромбозом (аккуратно, без повреждения самого сосуда, не дать сформироваться сгустку или «распилить» уже сформировавшийся), но диагностировать наличие тромба до тех пор, пока он не начал доставлять серьёзных неприятностей, непросто. Поэтому создание лекарства, которое предотвращает образование тромбов (особенно у групп риска), спасло бы миллионы жизней. А нахождение вещества, подавляющего активность сериновой протеиназы тромбина, сразу «выключало» бы этот фермент из сложной цепи реакций, вытаскивая костяшку из огромной череды домино и останавливая падение следующих. И это лишь один из примеров возможного использования в будущем свойств белков этого класса.
Разумеется, на двухнедельной школе никто не ставил цели открыть универсальное лекарство от всех болезней — мы хотели лишь выделить и изучить ингибиторы (заодно выделялись и протеиназы — из личинок мясной мухи). Никто не утверждает, что если кушать много репки и свёклы — можно спастись от тромбоза (собственно, способность наших ингибиторов как-то воздействовать на тромбин ещё не проверялась, да и не в этом состояла задача Школы). Тем более, что через желудочно-кишечный тракт ингибиторы в кровь не попадут — расщепятся. Однако проделанная работа — капля в море — чернильной точкой закроет ещё одно (пусть и небольшое) белое пятнышко в науке. Или — что даже важнее — станет поворотным моментом в судьбе детей, которые, выполняя её, получили шанс погрузиться в настоящую лабораторную жизнь.
Лабораторная работа.
Вытянули репку!
То, что ингибиторы трипсина вообще содержатся в репе и свёкле, впервые было установлено в ходе работы лаборатории системной биологии (под руководством Михаила Пантелеева) на Школе молекулярной и теоретической биологии в 2013 году. Активность ингибиторов, содержащихся в экстракте свёклы (Beta vulgaris) и репы (Brassica rapa) проверялась по эффекту на модельную инфекцию (грибок Aspergillus flavus или бактерия Esherichia coli). По первоначальному замыслу, рост патогенных грибков и бактерий должен был быть подавлен добавлением ингибиторов (выделенных методами фильтрования, центрифугирования, термообработки и доведения рН) по сравнению с контролем — ампициллином для кишечной палочки и клотримазолом для гриба.
Однако тогда было очищено недостаточное количество белка (вероятнее, даже нескольких белков) для аминокислотного секвенирования, и даже наличия белков в репе доказать не удалось. В
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография (от лат. affinis — родственный) (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству) — метод очистки и разделения белков, обычно используемый для очистки ингибиторов и основанный на их способности взаимодействовать с лигандом (в нашем случае, трипсином, с которым, разумеется, и должен связываться его ингибитор, чтобы подавлять его). Мы добавили трипсин к сефарозе, активированной бромцианом, в результате чего он присоединился к ней своими аминогруппами, как это показано на рисунке:
Оставшиеся «хвостики», которые могли присоединить к себе ненужные белки, мы «заткнули» с помощью аминокислоты глицина. Так получилась «удочка», на которую мы и ловили наши ингибиторы. Свой «улов» смывали в несколько приёмов, и то, что получилось (см. элюат 1 на картинке), нанесли на белковый электрофорез*, чтобы выделить белки нужной длины.
* — Электрофорез белков (напомним, что он отличается от электрофореза ДНК, главным образом, вертикальным расположением камеры и составом геля, но главный принцип — движение заряженных молекул под действием электрического поля сквозь пористый гель со скоростью, обратно пропорциональной размеру молекул — остаётся тем же) был проведён в полиакриламидном геле.
Гельэлектрофорез. МВ — маркер молекулярного веса белков (в килодальтонах).
После (с помощью измерения поглощения фиолетового света на спектрофотометре) сравнивалась активность трипсина в присутствии ингибитора и без него: фермент взаимодействовал с меченым субстратом, отщепляя краситель, в результате чего смесь желтела, а ингибитор этому мешал. Спектрофотометр фиксировал изменения цвета. На основании полученных данных мы оценили константу ингибирования (Ki = 15—60±10 нМ). Вот как комментирует этот результат Владимир Колядко, сотрудник Лаборатории системной биологии и биофизики на ШМТБ: «При такой концентрации половина всех молекул трипсина подавлена. Много это или мало? Это означает, что для защиты от трипсина достаточно всего лишь порядка 10−8 моль/литр ингибитора — такой же эффективностью обладают многие „лекарственные“ ингибиторы».
Установлено, что активность трипсина подавляется ингибитором на 95% (у нас было два типа трипсина: коммерческий и выделенный на Школе из личинок мясной мухи). Дальнейшее изучение найденных белков покажет возможность их практического применения.
Благодарности
Выражаю благодарности сотрудникам Лаборатории системной биологии и биофизики на ШМТБ: Колядко В.Н.; Корнеевой В.А.; Нечипуренко Д.Ю.; Овсепян Р.А.; Подоплеловой Н.А.; школьникам-участникам, дирекции Школы. Без них эта статья не была бы написана, а работа — сделана.
Литература
| ||
суббота, 29 ноября 2014 г.
Ингибируй, властвуй, понижай
