Микробиолог Константин Северинов о природе генных болезней, технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 и репарации ДНК
Среди
огромного количества болезней, которые поражают род людской, кроме
прионных инфекций, которые могут быть бактериальной или вирусной
природы, есть определенный класс болезней — он не очень широкий — так
называемые генные болезни.
И природа их связана с тем, что кому-то из нас сильно не повезло, и мы получили от папы, или от мамы, или от обоих неправильную копию гена, которая кодирует, например, белок с измененной функцией, и изменение этой функции приводит к возникновению самых разных патологий. Есть масса болезней крови такого рода. Например, серповидно-клеточная анемия или различные трисомии, муковисцидоз является такой болезнью.
На сегодняшний момент медицина прекрасно знает, какие именно изменения в каких генах ответственны за простые, или так называемые моногенные, болезни, которые реально определяются изменением только одного гена. В большинстве случаев это приговор — в том смысле, что мало что можно в таком случае предпринять: это не бактерия, которая вас поразила, и в этом смысле ни антибиотик, ничто другое ваше физиологическое состояние изменить не может.
Подход, который в таком случае хотелось бы применить, называется геномной медициной, и чисто концептуально понятно, что нужно плохую копию гена, неудавшуюся, неудачную последовательность ДНК, изменить, с тем чтобы она пришла в норму, стала такая же, как у нормальных людей, что бы это ни значило. И в таком случае болезнь должна исчезнуть просто потому, что причины для нее больше не будет. В идеале хорошо делать это еще на стадии зачатия, потому что именно тогда яйцеклетка, мы все присутствуем в виде одной-единственной клетки. Просто после того, как происходит развитие и каждый из нас состоит уже из триллионов клеток, излечить такого рода генетическую опечатку в каждой из многочисленных клеток нашего организма будет чисто технически очень сложно.
И совсем недавно возникли подходы, которые позволяют бороться с такого рода геномными болезнями. Этот подход называется геномное редактирование, он связан с развитием технологии CRISPR/Cas, которая пришла к нам, как и многое другое, из мира бактерий — бактерии борются с вирусами, у них тоже есть свои напасти. И тот способ, который бактерии придумали в результате эволюции, связан с тем, что они получили возможность узнавать генетический материал вируса за счет комплементарных взаимодействий.
Вообще вся жизнь построена на комплементарном взаимодействии. Тот, кто любит философию, может тут же подумать про инь и ян. Есть две цепи ДНК, которые подходят друг другу, как инь и ян, и каждая из цепей ДНК, с одной стороны, несет генетическую информацию в виде последовательностей нуклеотидов, а с другой стороны, если разделить эти две цепи, то можно по одной цепи, как по матрице, построить недостающую. Таким образом, у нас из одной молекулы стало две молекулы, а потом четыре и так далее.
Технология CRISPR/Cas построена на том, как бактерии используют это следующим образом: они используют одну короткую молекулу нуклеиновой кислоты — не ДНК, а РНК, — для того чтобы узнавать участок ДНК-вируса, при этом они узнают по комплементарному правилу. И после того, как такое узнавание происходит — а происходит узнавание именно ДНК-вируса, ничего другого, потому что это очень точное узнавание, — то с помощью специальных белков вирусная ДНК разрушается, и клетка оказывается спасена: вирус уничтожен.
И выяснилось, что ровно то же самое работает в клетках высших организмов, например человека, а именно: если взять бактериальный белок под названием Cas и ввести его в клетку млекопитающего и если в эту же клетку млекопитающего ввести каким-то образом — есть соответствующие технологии — очень короткую нуклеиновую кислоту, рибонуклеотид РНК, последовательность которой точно соответствует какой-то измененной копии человеческого гена, совсем маленького участка, то произойдет комплементарное узнавание, и затем эта копия гена, которая соответствует РНК, будет не уничтожена, а в нее просто будет внесен двунитевой разрыв, ДНК разорвется на две части — была одна длинная молекула ДНК, а сейчас в нее внесен разрыв.
Достоинство этой системы заключается в том, что она исключительно прецизионна, по крайней мере для бактерий она очень точна.
На этом основана геномная медицина, потому что, если вы можете внести прецизионный раскус в то место гена, которое приводит к каким-то нежелательным последствиям, то потом в результате процедуры под названием репарация вы просто излечите ее редактированием. И это прекрасно работает, то есть самое удивительное, что эта система из бактерий, с помощью которой бактерии борются с вирусами, работает в клетках высших организмов, когда бактериальные белки — не наши белки — в наших клетках выполняют такого рода функцию.
Эта технология выстрелила в том смысле, что CRISPR/Cas-системы стали применяться для редактирования клеток высших организмов, это произошло в 2013 году. И в 2015 году появилось сообщение о том, что наконец-то — естественно, это был просто вопрос времени — сделаны попытки отъюстировать, подредактировать, чуть-чуть исправить человеческие эмбрионы. В конечном счете все делалось ради этого, в этом и состоит святой Грааль геномной медицины.
Был проведен следующий опыт: бралась оплодотворенная человеческая яйцеклетка, и эта яйцеклетка имела испорченный ген, две копии гена, приводящего к болезни крови, которая называется бета-талассемия. Результатом этой болезни является анемия, недостаточный перенос кислорода красными клетками крови, около сотни миллионов людей страдают от этой болезни, и десятки тысяч людей в год умирают. Было бы неплохо все это излечить. Сказано — сделано. И опыт, казалось бы, очень простой. Как и предполагается по CRISPR/Cas-технологии, в эту оплодотворенную яйцеклетку был введен белок Cas и этот РНК-гид, который должен был неправильную копию гена раскусить, с тем чтобы потом ее залечили. А дальше после такой процедуры лечения эмбрионам позволили расти, потому что это была оплодотворенная яйцеклетка. Слава богу, позволили им расти недолго, совсем до небольшого количества, сгусточка клеток. А потом посмотрели, что же стало с этими эмбрионами на уровне генома: излечились ли они или нет? И результат был такой, что некоторые излечивались, в 5–10% случаев исходное изменение, которое было бы ответственно за болезнь, если бы это был настоящий человек, действительно оказалось излеченным — это хорошая новость. Процент низкий, но, очевидно, технологию можно доработать и повысить процент.
Плохая новость оказалась в том, что почти во всех клетках присутствовало еще большое количество изменений, то есть мутаций, которые были вовсе не в тех местах, на которые хотели обратить свое внимание исследователи. В научных терминах это называется неспецифическая активность, то есть эта CRISPR/Cas-система вносила раскусы, а затем изменения не только в то место, куда хотелось, но и в другие места генома. К сожалению, это большая проблема, с которой, по-видимому, нельзя будет никак бороться разумными методами, и связано это просто с природой макромолекулярных взаимодействий.
Рассмотрим ситуацию, когда участок ДНК длиной 20 нуклеотидов (20 букв) специфически взаимодействует с РНК-гидом, а это правильное взаимодействие — оно прочное: хорошее соответствие предопределяет прочное взаимодействие и в конечном счете внесение раскуса и все остальное. Но ведь в клетке — это можно показать чисто статистически — существует 3 умножить на 20 (три — потому что всего есть четыре буквы ДНК), то есть 60 вариантов этой правильной последовательности, отличающихся лишь на одну букву.
Как с этим быть — неясно. Люди пытаются использовать какие-то биоинформатические протоколы, чтобы искать именно такие позиции, которые действительно уникальны в геноме. Но проблема только в том, что Господь Бог или еще кто-то, тот, кто делает мутации, которые вызывают генетические болезни, не руководствуется соображениями такого рода, и поэтому есть масса участков, которые хотелось бы излечить, но, к сожалению, подобраться к ним именно с этой технологией очень сложно.
Другим примером, перед которым эта технология оказывается совершенно точно бессильной, являются так называемые болезни, вызванные повторами. Есть очень простые участки ДНК — например, ДНК состоит из четырех букв, но есть участки ДНК, в которых повторяется много раз одна и та же буква — G G G G G. Оказывается, что при репликации, при размножении, при копировании такого рода участков ДНК спонтанно происходят ошибки: одна лишняя буква G вставилась или недостача одной буквы. И болезней, связанных с такого рода механизмом, очень много — болезней простых повторов. И совершенно очевидно, что CRISPR/Cas-технология не позволяет бороться с такими болезнями, потому что участок с очень простой вырожденной последовательностью невозможно узнать, его можно узнать самыми разными способами, комплементарное взаимодействие с таким участком возможно в разных регистрах. И вы полностью теряете возможность контролировать процесс редактирования, а следовательно, возможность вылечить болезнь.
И природа их связана с тем, что кому-то из нас сильно не повезло, и мы получили от папы, или от мамы, или от обоих неправильную копию гена, которая кодирует, например, белок с измененной функцией, и изменение этой функции приводит к возникновению самых разных патологий. Есть масса болезней крови такого рода. Например, серповидно-клеточная анемия или различные трисомии, муковисцидоз является такой болезнью.
На сегодняшний момент медицина прекрасно знает, какие именно изменения в каких генах ответственны за простые, или так называемые моногенные, болезни, которые реально определяются изменением только одного гена. В большинстве случаев это приговор — в том смысле, что мало что можно в таком случае предпринять: это не бактерия, которая вас поразила, и в этом смысле ни антибиотик, ничто другое ваше физиологическое состояние изменить не может.
Подход, который в таком случае хотелось бы применить, называется геномной медициной, и чисто концептуально понятно, что нужно плохую копию гена, неудавшуюся, неудачную последовательность ДНК, изменить, с тем чтобы она пришла в норму, стала такая же, как у нормальных людей, что бы это ни значило. И в таком случае болезнь должна исчезнуть просто потому, что причины для нее больше не будет. В идеале хорошо делать это еще на стадии зачатия, потому что именно тогда яйцеклетка, мы все присутствуем в виде одной-единственной клетки. Просто после того, как происходит развитие и каждый из нас состоит уже из триллионов клеток, излечить такого рода генетическую опечатку в каждой из многочисленных клеток нашего организма будет чисто технически очень сложно.
И совсем недавно возникли подходы, которые позволяют бороться с такого рода геномными болезнями. Этот подход называется геномное редактирование, он связан с развитием технологии CRISPR/Cas, которая пришла к нам, как и многое другое, из мира бактерий — бактерии борются с вирусами, у них тоже есть свои напасти. И тот способ, который бактерии придумали в результате эволюции, связан с тем, что они получили возможность узнавать генетический материал вируса за счет комплементарных взаимодействий.
Вообще вся жизнь построена на комплементарном взаимодействии. Тот, кто любит философию, может тут же подумать про инь и ян. Есть две цепи ДНК, которые подходят друг другу, как инь и ян, и каждая из цепей ДНК, с одной стороны, несет генетическую информацию в виде последовательностей нуклеотидов, а с другой стороны, если разделить эти две цепи, то можно по одной цепи, как по матрице, построить недостающую. Таким образом, у нас из одной молекулы стало две молекулы, а потом четыре и так далее.
Технология CRISPR/Cas построена на том, как бактерии используют это следующим образом: они используют одну короткую молекулу нуклеиновой кислоты — не ДНК, а РНК, — для того чтобы узнавать участок ДНК-вируса, при этом они узнают по комплементарному правилу. И после того, как такое узнавание происходит — а происходит узнавание именно ДНК-вируса, ничего другого, потому что это очень точное узнавание, — то с помощью специальных белков вирусная ДНК разрушается, и клетка оказывается спасена: вирус уничтожен.
И выяснилось, что ровно то же самое работает в клетках высших организмов, например человека, а именно: если взять бактериальный белок под названием Cas и ввести его в клетку млекопитающего и если в эту же клетку млекопитающего ввести каким-то образом — есть соответствующие технологии — очень короткую нуклеиновую кислоту, рибонуклеотид РНК, последовательность которой точно соответствует какой-то измененной копии человеческого гена, совсем маленького участка, то произойдет комплементарное узнавание, и затем эта копия гена, которая соответствует РНК, будет не уничтожена, а в нее просто будет внесен двунитевой разрыв, ДНК разорвется на две части — была одна длинная молекула ДНК, а сейчас в нее внесен разрыв.
Достоинство этой системы заключается в том, что она исключительно прецизионна, по крайней мере для бактерий она очень точна.
Только в условиях полного соответствия
РНК-гида и матрицы ДНК будет взаимодействие молекул, которое приведет к
расщеплению цепи ДНК.
Почему хорошо расщепить ДНК? Так как каждый из нас содержит два
набора генов — один от папы, один от мамы, — представьте себе ситуацию,
что папин ген (мама ничего плохого не может нам дать, хотя в случае с
гемофилией это не так) не задался, в нем есть мутация, которая приводит к
какому-то тяжелому физиологическому состоянию, а мамин совершенно
нормальный. Так вот, если мы можем расщепить папину неправильную копию в
том месте, где произошла мутация, то клетка уже сама собой — клетки
эволюцией приучены к тому, что разрывы в ДНК происходят — залечивает
разрыв по оставшейся здоровой копии, и если папина плохая копия
расщепилась, то по маминой можно все восстановить.
На этом основана геномная медицина, потому что, если вы можете внести прецизионный раскус в то место гена, которое приводит к каким-то нежелательным последствиям, то потом в результате процедуры под названием репарация вы просто излечите ее редактированием. И это прекрасно работает, то есть самое удивительное, что эта система из бактерий, с помощью которой бактерии борются с вирусами, работает в клетках высших организмов, когда бактериальные белки — не наши белки — в наших клетках выполняют такого рода функцию.
Эта технология выстрелила в том смысле, что CRISPR/Cas-системы стали применяться для редактирования клеток высших организмов, это произошло в 2013 году. И в 2015 году появилось сообщение о том, что наконец-то — естественно, это был просто вопрос времени — сделаны попытки отъюстировать, подредактировать, чуть-чуть исправить человеческие эмбрионы. В конечном счете все делалось ради этого, в этом и состоит святой Грааль геномной медицины.
Был проведен следующий опыт: бралась оплодотворенная человеческая яйцеклетка, и эта яйцеклетка имела испорченный ген, две копии гена, приводящего к болезни крови, которая называется бета-талассемия. Результатом этой болезни является анемия, недостаточный перенос кислорода красными клетками крови, около сотни миллионов людей страдают от этой болезни, и десятки тысяч людей в год умирают. Было бы неплохо все это излечить. Сказано — сделано. И опыт, казалось бы, очень простой. Как и предполагается по CRISPR/Cas-технологии, в эту оплодотворенную яйцеклетку был введен белок Cas и этот РНК-гид, который должен был неправильную копию гена раскусить, с тем чтобы потом ее залечили. А дальше после такой процедуры лечения эмбрионам позволили расти, потому что это была оплодотворенная яйцеклетка. Слава богу, позволили им расти недолго, совсем до небольшого количества, сгусточка клеток. А потом посмотрели, что же стало с этими эмбрионами на уровне генома: излечились ли они или нет? И результат был такой, что некоторые излечивались, в 5–10% случаев исходное изменение, которое было бы ответственно за болезнь, если бы это был настоящий человек, действительно оказалось излеченным — это хорошая новость. Процент низкий, но, очевидно, технологию можно доработать и повысить процент.
Плохая новость оказалась в том, что почти во всех клетках присутствовало еще большое количество изменений, то есть мутаций, которые были вовсе не в тех местах, на которые хотели обратить свое внимание исследователи. В научных терминах это называется неспецифическая активность, то есть эта CRISPR/Cas-система вносила раскусы, а затем изменения не только в то место, куда хотелось, но и в другие места генома. К сожалению, это большая проблема, с которой, по-видимому, нельзя будет никак бороться разумными методами, и связано это просто с природой макромолекулярных взаимодействий.
Рассмотрим ситуацию, когда участок ДНК длиной 20 нуклеотидов (20 букв) специфически взаимодействует с РНК-гидом, а это правильное взаимодействие — оно прочное: хорошее соответствие предопределяет прочное взаимодействие и в конечном счете внесение раскуса и все остальное. Но ведь в клетке — это можно показать чисто статистически — существует 3 умножить на 20 (три — потому что всего есть четыре буквы ДНК), то есть 60 вариантов этой правильной последовательности, отличающихся лишь на одну букву.
Таким образом, существует 60
последовательностей, которые очень похожи на то, что вы хотите
таргетировать, но чуть-чуть отличаются.
Каждая из них взаимодействует чуть хуже, чем идеал, — допустим, в 10
раз, но их очень много. Кроме того, в клетке уже будет присутствовать 60
умножить на 60, то есть 3600 вариантов последовательности, которые
отличаются от того, что вы хотите подлечить, только на две буквы и так
далее. И здесь возникает проблема: несмотря на то, что взаимодействие с
правильной мишенью самое прочное, реальное количество неправильных —
чуть-чуть или чуть больше неправильных — последовательностей настолько
огромное, что в подавляющем большинстве случаев этот редакционный
комплекс CRISPR/Cas будет находиться не там, где надо. И хотя каждое из
таких взаимодействий с не очень правильными мишенями будет очень
короткое и непрочное, в сумме оно будет достаточным для того, чтобы в
это неправильное место был внесен разрыв ДНК, а дальше пошла какая-то
процедура репарации, которая сама по себе вносит мутации в геном.
Как с этим быть — неясно. Люди пытаются использовать какие-то биоинформатические протоколы, чтобы искать именно такие позиции, которые действительно уникальны в геноме. Но проблема только в том, что Господь Бог или еще кто-то, тот, кто делает мутации, которые вызывают генетические болезни, не руководствуется соображениями такого рода, и поэтому есть масса участков, которые хотелось бы излечить, но, к сожалению, подобраться к ним именно с этой технологией очень сложно.
Другим примером, перед которым эта технология оказывается совершенно точно бессильной, являются так называемые болезни, вызванные повторами. Есть очень простые участки ДНК — например, ДНК состоит из четырех букв, но есть участки ДНК, в которых повторяется много раз одна и та же буква — G G G G G. Оказывается, что при репликации, при размножении, при копировании такого рода участков ДНК спонтанно происходят ошибки: одна лишняя буква G вставилась или недостача одной буквы. И болезней, связанных с такого рода механизмом, очень много — болезней простых повторов. И совершенно очевидно, что CRISPR/Cas-технология не позволяет бороться с такими болезнями, потому что участок с очень простой вырожденной последовательностью невозможно узнать, его можно узнать самыми разными способами, комплементарное взаимодействие с таким участком возможно в разных регистрах. И вы полностью теряете возможность контролировать процесс редактирования, а следовательно, возможность вылечить болезнь.
Константин Северинов
доктор
биологических наук, профессор Сколковского института науки и технологий
(SkolTech), профессор Университета Ратгерса (США), заведующий
лабораторией молекулярной, экологической и прикладной микробиологии
СПбПУ Петра Великого
