От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Оглавление
Заведующий лабораторией — Павел Волчков — прокомментировал для «биомолекулы» некоторые из громких открытий и разработок в этой области. Но сначала расскажем подробнее, о чем же речь. Откуда мы знаем про CRISPR-Cas9?В качестве высокоточного инструмента редактирования ДНК технология CRISPR-Cas9 была разработана в 2012–2013 годах [2]. Однако знакомство исследователей с молекулярным механизмом, ставшим основой «умных ножниц для ДНК», случилось гораздо раньше и было обязано бактериям, а именно защитному механизму, позволяющему им выходить победителями из встречи с вирусами и другими патогенами.В основе этого механизма лежат особые участки генома — CRISPR, обнаруженные впервые в 1987 году Ёсидзуми Исино у кишечной палочки (Escherichia coli) [3] и представляющие собой одинаковые повторяющиеся последовательности (CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats), чередующиеся с уникальными участками (спейсерами). Эти уникальные последовательности — «фотоальбом», в котором бактерия хранит «фотографии» всех патогенов, ранее встреченных ею или ее предками. Благодаря этим «фотографиям» при будущих встречах с данными патогенами бактерия имеет высокие шансы вовремя распознать их и обезоружить. Помогают ей в этом специальные комплексы белков Cas, ассоциированные в геноме с CRISPR-локусами и участвующие в уничтожении чужеродного генетического материала, а также помогающие добавлять и запоминать фотографии новых патогенов, попадающих в клетку. Осуществляется это запоминание за счет вырезания характерного для данного патогена участка ДНК и встраивания его в виде нового спейсера в геном бактерии (подробности этого механизма приведены в детальном обзоре [4] и симпатичной инфографике [5]). Превращение механизма бактериального иммунитета в инструмент редактирования геномов высших организмов потребовало решения ряда сложных задач, связанных, главным образом, с повышением точности определения участка ДНК, который распознается и вырезается комплексом белка Cas9 со специальной молекулой РНК, служащей для белка гидом к этому участку. Однако труды генных инженеров увенчались успехом и уже к 2013 году позволили создать удобный способ доставки молекулярного комплекса CRISPR-Cas9, который был опробован на культуре человеческих клеткок [6]. Будучи успешно испытанной на клетках многих модельных организмов и доказав свою эффективность на этой стадии, технология CRISPR-Cas9 приковала всеобщее внимание как перспективный инструмент в клинической практике для лечения многих заболеваний, включая наследственные и онкозаболевания. На настоящий момент развитие технологии вплотную подошло к проверке ее эффективности в клинических испытаниях. Первый рывок в гонке клинических испытаний CRISPR-CasО подготовке к проведению клинических испытаний технологии CRISPR-Cas9 заявили сразу две исследовательские группы — из Китая и США. В этой биомедицинской гонке, прозванной с легкой руки американского иммунолога Карла Джуна «Спутник 2.0», китайской группе удалось вырваться вперед на самом старте, впервые сделав пациенту инъекцию, содержащую его собственные иммунные клетки, отредактированные с помощью CRISPR-Cas9 для борьбы с агрессивным раком легких [7]. Исследователи отобрали Т-лимфоциты пациента и вырезали в них ген, кодирующий белок PD-1 (Programmed cell death 1), затормаживающий иммунный ответ и дающий опухолевым клеткам возможность избежать инактивации, уходя из-под надзора иммунной системы. После редактирования клетки с измененным геномом культивировали в присутствии цитокинов, а затем инъекционно вводили обратно пациенту с расчетом на то, что отредактированные клетки будут эффективнее уничтожать клетки опухоли. Данный подход представляет собой редактирование клеток пациента ex vivo и является одним из возможных для использования в терапии (рис 1). Стоит отметить, что ингибирование PD-1 — уже устоявшийся подход в иммунотерапии многих опухолевых заболеваний [8, 9]. На настоящий момент зарегистрировано более 170 клинических испытаний, направленных на проверку новых ингибиторов PD-1. Рисунок 1. In vivo и ex vivo подходы к использованию CRISPR-Cas9 в генной терапии. Китайские исследователи использовали ex vivo
подход к редактированию клеток пациента. Однако он — лишь один из двух
возможных вариантов лечения патологий с помощью CRISPR-Cas9. а — In vivo CRISPR-Cas9-система доставляется прямо в организм пациента с использованием специальных векторов вирусного или не вирусного происхождения и позволяет произвести редактирование в организме самого пациента. б — Ex vivo
редактированию с помощью CRISPR-Cas9 подвергаются, например,
соматические стволовые или прогениторные клетки, которые были
первоначально взяты у пациента. После редактирования клетки с измененным
геномом отбирают, растят в культуре и трансплантируют (инъецируют)
обратно пациенту. Рисунок из [10]. Чтобы посмотреть в полном размере, нажмите на рисунок.Уникальна ли CRISPR-Cas в качестве технологии геномного редактирования?Несмотря на явное преимущество по уровню информационного освещения, технология CRISPR-Cas9 не является единственной технологией редактирования ДНК, которая может использоваться для лечения реальных заболеваний.В 2014 году американские исследователи впервые провели испытания технологии с использованием ферментов, имеющих домены «цинковые пальцы» (Zinc-finger nucleases, ZFNs), на пациентах с ВИЧ. Испытания проводили на 12 пациентах с целью избавить иммунные клетки от гена ССR5, уменьшающего их резистентность к ВИЧ [11]. Исследователи постарались вырезать этот ген в Т-лимфоцитах, поскольку белок ССR5 служит для вируса в качестве «пропускного пункта» в эти клетки, и люди, имеющие мутации в гене ССR5, обладают устойчивостью к ВИЧ [12, 13]. В данных испытаниях иммунные клетки подверглись редактированию ex vivo, в ходе которого они были выделены из крови пациентов и отредактированы с использованием коммерчески доступных нуклеаз с «цинковыми пальцами». Однако эффективность редактирования оказалась невысокой — только в 25% клеток редактирование нужного гена прошло успешно. Тем не менее после инъекции редактированных клеток в прогнозе пациентов были отмечены позитивные изменения — у всех 12 человек после прекращения антиретровирусной терапии уровень ВИЧ восстанавливался гораздо медленнее, чем в норме, а уровень Т-лимфоцитов оставался достаточно высоким в течение нескольких недель. Интересно, что у одного из пациентов уровень вируса не восстанавливался в течение целых 12 недель после остановки терапии. Авторы, исследовав геном пациента, обнаружили, что он имеет одну мутировавшую копию гена CCR5, что, по всей видимости, и позволило ему лучше сопротивляться вирусу по сравнению с другими пациентами. Несмотря на достигнутые положительные результаты, испытание данной технологии выявило ряд сложностей, делающих их использование в терапии затруднительным. Во-первых, это недостаточная точность редактирования ДНК в клетках пациентов. Во-вторых, в ходе испытания у пациентов отмечались некоторые малоприятные побочные эффекты, вызванные инъекцией. Например, не исчезающий в течение нескольких дней ужасный запах, исходящий от тел пациентов, возникающий вследствие метаболизма диметилсульфоксида (ДМСО), который используется в качестве криоконсерванта для клеточной культуры [14]. Однако последующие работы исследователей позволили улучшить технологию использования нуклеаз с «цинковыми пальцами», и на сегодняшний день компания Sangamo, впервые применившая ее для лечения пациентов, уже провела испытания на 80 пациентах и получила более обнадеживающие результаты. Вторым видом технологии геномного редактирования стало использование фермента TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) для спасения маленькой однолетней пациентки с лейкемией в Британии [15]. Испытать подобную технологию авторы исследования решились после того, как все остальные способы лечения ребенка потерпели неудачу. Исследователи использовали Т-лимфоциты, взятые у здорового донора, повысив их устойчивость к противоопухолевым препаратам и модифицировав с помощью технологии UCART (Universal Chimeric Antigene Receptor T-cells), позволяющей им атаковать опухолевые клетки, но не причинять вреда здоровым клеткам пациентки. Авторы признались, что инъекция подобных иммунных клеток с редактированной ДНК не позволяет однозначно вылечить заболевание, однако у пациента появляется шанс дождаться подходящего донора костного мозга. И в данном случае такой донор был найден. Модифицированные иммунные клетки позволили организму девочки побороть опухолевые клетки, а трансплантация — восстановить иммунную систему, сильно пострадавшую в ходе курса химиотерапии и борьбы с опухолью. Случай выздоровления юной пациентки получил широкий общественный резонанс и позволил технологиям редактирования генетической информации еще на шаг приблизиться к применению в клинической практике. Комментарий Павла Волчкова, заведующего лабораторией геномной инженерии МФТИ Рисунок 2. Павел Юрьевич Волчков, заведующий лабораторией геномной инженерии МФТИСейчас мы наблюдаем, пожалуй, самый большой из пиков, и связан он с развитием системы CRISPR-Cas9. Если сравнивать интерес к применению всех трех технологий и расположить его на определенном ландшафте, то пик, происходящий сейчас с CRISPR-Cas9, это еще не «Гималаи», но уже как минимум «Альпы». Важно также понимать, что переход между этими «высотами» связан с нашими ожиданиями от технологии, а они имеют колебательный характер — интерес к продукту растет соответственно ее громким успехам и падает, если ожидания этих успехов сильно затягиваются. Примерно по такому же принципу изменяется и финансирование разработки технологии. В конечном итоге судьба каждого успешного продукта — это выйти на определенное плато, где компании, выпускающие его, начинают получать максимальную выгоду. Если искать причины, почему именно CRISPR-Cas9 вызвал наибольший ажиотаж вокруг технологий редактирования генома, то стоит отметить следующие вещи. Во-первых, весь этот информационный бум был, действительно, хорошо сгенерирован. А во-вторых, технология CRISPR-Cas9 хороша благодаря своей исключительной универсальности. Она позволяет получить нуклеазу нужной вам специфичности в минимально короткое время по сравнению с ZNFs и TALEN. Это довольно сильное преимущество, поскольку специфичность и эффективность ферментов из всех трех технологий практически одинакова. Sangamo, пионеры в области создания нуклеаз «цинковых пальцев», оттачивали их дизайн десятилетиями, так что их специфичность ничуть не уступает другим нуклеазам. Однако здесь и кроется отличительная черта CRISPR-Cas9 — это возможность максимально быстро преодолевать стадию дизайна, практически в один шаг. Вы имеете возможность быстро создать десяток молекул-гидов для нуклеазы Cas9 и проверить их эффективность и специфичность на нужном вам участке ДНК. Дальнейшая доработка технологии примерно одинакова во всех трех случаях — это определения способа доставки системы в нужные клетки, проработка клинической составляющей и других сопутствующих технологий. Важно понимать, что сам молекулярный механизм, производящий редактирование ДНК, это важная составляющая будущего клинического продукта, но одной ее недостаточно для того, чтобы лечить пациентов. В список сопутствующих технологий, необходимых для использования геномного редактирования в терапии, входят методы культивирования клеток, которые предполагается редактировать (например, Т-клетки иммунной системы), а также технологии доставки редактирующей молекулярной системы (например, использование вирусных векторов). Кроме того, развитие технологий геномного редактирования толкает вперед развитие приборостроения, поскольку машин, которые автоматически выполняли ли бы всю работу, связанную, например, с отобранными клетками, в клинике сейчас нет. Однако такие машины просто необходимы, поскольку нам важны время и автоматизация процесса для эффективной терапии. Что же касается заболеваний, в лечении которых планируется попробовать использовать CRISPR-Cas9, то их список достаточно обширен. Editas — одна из крупнейших и многообещающих компаний, разрабатывающих клинические продукты на основе CRISPR-Cas9, — решила сфокусировать свое внимание на заболеваниях, лечение для которых на настоящий момент практически отсутствует или является недостаточно эффективным (см. таблицу).
Для всех групп заболеваний в качестве корректирующего механизма Editas планирует использовать технологии, основанные на разных способах репарации ДНК после ее разрезания Cas9. Эти технологии включают в себя такие механизмы репарации, как негомологичное соединение концов (non-homologous end joining, NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (homology directed repair, HDR) [16]. Старт клинических испытаний намечен на 2017 год, и Editas — не единственная компания, заявившая о них. Подобные схемы будущих испытаний уже предложили другие крупные компании — Intellia Therapeutics и Crispr Therapeutics. Никто не застрахован от ошибокНесмотря на громкий успех китайских исследователей, менее чем через неделю это событие оказалось омрачено печальной новостью из США. В ходе клинический испытаний, проводимых компанией Juno Therapeutics по редактированию Т-лимфоцитов пациентов с острым лимфобластным лейкозом, двое пациентов скончались по причине проявившихся осложнений после трансплантации редактированных клеток. На данный момент FDA — Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration) — приостановило испытания до полного выяснения обстоятельств и причин гибели пациентов. Некоторые эксперты предполагают, что данный прецедент может серьезно ограничить Juno в дальнейших разработках технологии CAR (chimeric antigen receptor) для модификации иммунных клеток онкопациентов.Случившиеся последовательно успех и неудача использования CRISPR-Cas9 в клинических испытаниях — хороший пример того, насколько сложен путь вхождения технологий геномного редактирования в практику для лечения реальных пациентов. Отбросив весь информационный шум, объективно можно сказать, что говорить об эффективности технологии, а главное о ее безопасности — довольно рано. Пока у нас нет данных успешных клинических испытаний с участием большого числа пациентов, ажиотаж вокруг развивающейся генной терапии будет подкрепляться исключительно общественными ожиданиями, но никак не реальными клиническими показателями. Тем не менее наши ожидания от технологий геномного редактирования огромны, и на настоящий момент представить ближайшее будущее без этих технологий довольно сложно (см. видео).
Видео. «Генная инженерия изменит всё и навсегда». Видео сделано группой Kurzgesagt и переведено Naked Science.
Литература
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
