ПОЛИМОРФИЗМ СИСТЕМЫ HLA У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗНЫХ СЛАВЯНСКИХ ЭТНИЧЕСКИХ ГРУПП (РУССКОЙ, БЕЛОРУССКОЙ И УКРАИНСКОЙ)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации: Комплекс генов HLA (главного комплекса гистосовместимости человека) компактно расположен на коротком плече 6-й аутосомной хромосомы, занимает 3500 kb (тысяч пар оснований) и содержит более 220 генов [Robinson J., Matthew J., 2001]. В состав HLA входят три группы генов: экспрессирующиеся гены, псевдогены и гены с неустановленной функцией [Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы]. Гены локуса HLA -DP, -DQ и –DR, ближайшие к центромере, кодируют молекулы II класса. Молекулы II класса определяются на поверхности так называемых антиген-представляющих (вспомогательных) клеток - дендритных, активированных макрофагов, В-лимфоцитов, а также активированных эндотелиальных, эпителиальных и тучных клеток, Т-хелперов [Ярилин А.А., 1999].

Система HLA является одной из наиболее полиморфных генетических систем, выполняющей в организме человека ряд функций, важнейшими из которых являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание иммунного гомеостаза, нарушение которого лежит в основе таких патологических процессов, как аутоиммунные заболевания и развитие опухолей [Акопян А.В., Алексеев Л.П, 1998]. Обеспечивая регуляцию иммунного ответа, гены HLA осуществляют генетический контроль взаимодействия всех иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, запуск и реализацию иммунного ответа и, в целом, обеспечивают выживание человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии [Хаитов Р.М., 2005]. Эти функции, в первую очередь, обусловлены двумя свойствами системы HLA: участием в презентации антигенного пептида и широким разнообразием – полиморфизмом аллельных вариантов каждого гена.

Для «запуска» адаптивного иммунного ответа на патоген, его антигенный пептид для распознавания Т-хелпером должен быть представлен антиген-представляющей клеткой только в контексте с молекулой HLA II класса [Dogerty P.C., Zinkernagel R.M, 1975].

Несмотря на мощное действие направленного отбора, полиморфизм системы HLA сохраняется и является необходимым элементом при взаимодействии человека с окружающей средой. Каждый из аллелей генов HLA обеспечивает возможность реагировать на определенный набор пептидов антигенов, и индивидуумы, которые гетерозиготны по HLA, могут иметь эффективный иммунный ответ на более разнообразный спектр антигенов и имеют намного больше шансов противостоять инфекции, что способствует поддержанию HLA-разнообразия на высоком уровне.

Исследование полиморфизма системы HLA является одним из наиболее эффективных подходов к изучению структуры и функции главного комплекса гистосовместимости человека. Необходимость подобных исследований обусловлена, в том числе и тем фактом, что без полного представления о строении системы генов тканевой совместимости невозможно успешное развитие клинической трансплантологии, и в первую очередь, это касается пересадки аллогенного костного мозга.

Для изучения полиморфизма системы HLA класса II используется, в основном, анализ особенностей распределения DRB1 гена. Объяснением этого факта может служить значительно более выраженный полиморфизм гена DRB1, по сравнению с DQA1 и DQB1 генами. Гаплотипичесие сочетания DRB1-DQA1-DQB1, вследствие их еще большей вариабельности, лучше отражают разнообразие HLA-системы.

В последние 25 лет появилась возможность исследования HLA на качественно новом молекулярно-генетическом уровне при помощи полимеразной цепной реакции. Принципиальным отличием новых методов явилось использование в качестве объекта исследования непосредственно генетического материала (участков ДНК, определяющих аллельный полиморфизм системы HLA) [Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., 2000]. Результатом этого стало заметное увеличение количества известных специфичностей HLA - со 150 в 1991 году [Tsuji K., Aizava M., 1992], 472 в 1998 году [Bodmer J.G., Marsh S.G., 1999] до примерно 2500 (данные на 2006 год) аллелей [Marsh S.G.E., 2006]. При этом среди вновь открытых аллелей установлены аллели чрезвычайно выраженной ассоциации с заболеваниями [Cotton R., 1989].

Исследования полиморфизма HLA в различных этнических группах позволяют обнаруживать все новые аллельные варианты генов HLA. В последние годы благодаря распространению в России молекулярно–генетических методов изучения HLA появилась возможность исследования аллельного разнообразия генов HLA в разных этнических группах, в том числе славянских, проживающих как на территории России, так и вне ее.

Данные, полученные в результате изучения распределения генов II класса главного комплекса гистосовместимости в различных этнических группах, могут быть использованы для развития клинической трансплантологии, направления “HLA и болезни”, криминалистики (идентификация личности) и такой фундаментальной науки, как антропология, поэтому представлялось целесообразным проведение исследования, посвященного изучению HLA–разнообразия в популяциях, принадлежащих к различным этническим группам, на современном молекулярно–генетическом уровне.

Цель работы: Изучить полиморфизм специфичностей генов HLA II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) и их гаплотипических сочетаний в трёх различных восточнославянских этнографических популяциях: русской, белоруской и украинской с помощью ранее созданных в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» вариантов ДНК-типирования (выделение геномной ДНК из периферической крови, типирование генов HLA класса II методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле) с целью последующего использования полученных данных для развития фундаментальной биологической науки (антропология и иммуногенетика) и для прикладной медицины (клиническая трансплантология, «HLA и болезни»).

Задачи исследования:

1. Провести анализ распределения специфичностей HLA- DRB1, DQA1 и DQB1, а также их гаплотических сочетаний у здоровых представителей русской, белоруской и украинской популяций в сравнении с аналогичными данными для других популяционных групп.

2. Проанализировать генетическое родство исследованных популяций, как между собой, так и с некоторыми народами Европы.

3. На примере восточных славян изучить способность системы генов HLA отражать геногеографию этнических групп и возможность использования этой системы в популяционных исследованиях.

Научная новизна: В процессе работы впервые был проведен сравнительный анализ особенностей распределения специфичностей генов HLA II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) и их гаплотипических сочетаний на молекулярно–генетическом уровне среди представителей белорусских, украинских и русской популяций.

На основе полученных данных был проведен расчет генетических расстояний, что позволило оценить генетическое родство между исследованными этническими группами:

Оценено генетическое родство (по профилю распределения гена DRB1) исследованных популяций с некоторыми народами Европы и выявлены межпопуляционные различия.

Впервые на примере восточных славян, показано, что, несмотря на влияние направленного естественного отбора, распределение генов HLA II класса адекватно отражает геногеографию этнических групп, и особенности полиморфизма генов HLA могут быть использованы в популяционных исследованиях.

Впервые получены данные по распределению генов HLA II класса для восточнославянских популяций, которые могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний, для идентификации личности в судебной медицине.

Практическая значимость работы:

1. Данные о распределении специфичностей генов HLA II класса и их сочетаний у здоровых представителей белорусских, украинских и русской популяций могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний.

2. Полученные данные служат теоретической базой для практических рекомендаций в клинической трансплантологии по поиску доноров аллогенного костного мозга в пределах генетически близких популяционных групп.

3. Популяционные данные могут быть использованы в судебно-медицинской практике для идентификации личности.

4. Полученные данные могут быть использованы для изучения истории формирования таких генетически близких народов, как восточные славяне.

Публикации: Материалы диссертации опубликованы в 4 научных публикациях, изданных в России.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 117 источников. Работа содержит 21 таблицу и 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования были использованы образцы крови взрослых здоровых и неродственных между собой представителей пяти популяций, представляющих три восточнославянских этноса: две популяции белорусов (Витебская и Брестская области), две популяции украинцев (Львовская и Хмельницкая области) и русская популяция (Вологодская область).

Места обследования планировались так, чтобы изученные популяции дали представление о важнейших подразделениях генофонда каждого народа. Среди белорусов антропологи выделяют две важнейших группы – северных (представленных у нас выборкой из Витебской области) и южных (представленных у нас выборкой из Брестской области). Брестская популяция представляет белорусское Полесье. Антропологическое подразделение украинского этноса, в отличие от белорусского следует не по оси «север-юг», а по оси «запад-восток». В соответствии с этим нами были обследованы популяции, представляющие западный вариант антропологического типа украинцев (Львовская область) и восточный вариант (Хмельницкая область). Русская популяция представлена населением Вологодской области, которое, относясь в целом к северному варианту русского генофонда, в течение многих веков впитывало в себя и генные потоки из среднерусской полосы.

Каждая из пяти популяций представлена только коренным сельским населением, относящимся к целому ряду населенных пунктов и потому репрезентативно представляющим данную часть этнического ареала. В выборку включались только те неродственные между собой индивиды, все бабушки и дедушки которых относятся к данному этносу и родились в пределах данной популяции.

Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi, H.Erlich, 1989) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой на EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течении 1 мин. при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К кипячением в течение 5 минут в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20°С.

Концентрация ДНК определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50-100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 минут.

Полимеразная цепная реакция. Амплификация выделенной ДНК.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, и дГТФ), 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl, 50 мМ NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Концентрацию праймеров подбирали отдельно для каждой смеси. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" (НПФ "ДНК-Технология", Москва).

Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRB_sen и DRB_al), а во второй – пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR*03, DR*05, DR*06, DR*08 (праймеры DRB_38ns и DRB_al). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «МС-2», запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования) был следующим:

1.    94°C – 1 мин.

2.    94°С – 20 сек.   7 циклов

67°С – 2 сек.

3.    93°С – 2 сек.   28 циклов

65°С – 4 сек.

Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на втором раунде.

При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим (для термоциклера типа «МС-2», запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, точного(“precise”) регулирования):

1.    93°С - 5 сек.   15 циклов

64°С - 10 сек.

Типирование локуса DQA1 проводилось в два этапа. На первом раунде использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, а на втором раунде – пары праймеров, амплифицирующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301, *0401, *0501, *0601. Для проведения амплификации использовали программу, приведенную для амплификатора типа МС2, запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования:

1.    94°С - 1 мин.

2.    94°С - 20 сек.   7 циклов

58°С - 5 сек.

3.    92°С - 5 сек.   28 циклов.

56°С - 10 сек.

Продукты амплификации первого раунда разводили в 10 раз и использовали на втором раунде по следующей программе в режиме активного, точного(“precise”) регулирования:

1.    93ºС - 5 сек.   12 циклов

62ºС - 10 сек.

Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом раунде использовали пару праймеров, амплифицирующую все специфичности локуса DQB1. Температурный режим был следующий:

1.    94ºС - 1 мин.

2.    94ºС - 20 сек.   7 циклов

67ºС - 5 сек.

3.    93ºС - 1 сек.   28 циклов

65ºС - 2 сек.

На втором раунде использовали пары праймеров, амплифицирующих следующие специфичности: *0201, *0301. *0302, *0303, *0304, *0305, *0401/02, *0501, *0502/04, *0503, *0601, *0602/08; продукты первого раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме:

1.    93ºС – 1 сек.   12 циклов

67ºС – 2 сек.

Проведение электрофореза.

В каждую из лунок 3% агарозного геля под буфер отдельным наконечником вносят по 5 мкл окрашенного амплификата.

Электрофорез проводят при напряжении 200-250V.

Время проведения электрофореза: после окончания I этапа - 10 минут,

после окончания II этапа - 20 минут

После проведения электрофореза гель вынимали из прибора для электрофореза и просматривали на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Окрашивание геля проводили бромистым этидием. Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.

Статистическая обработка результатов.

Для определения частоты аллелей и трехлокусных гаплотипов методом максимального правдоподобия (maximum-liekelihood) использовали компьютерную программу «Арлекин», версия 2.1 (URL:http://anthro.unige.ch/arlequin)

Анализ генетических расстояний проводили с помощью компьютерных программ «DJgenetic» (расчет расстояний Нея) [Ю.Серегин и соавт.,1998г.] и «Statistica 6.0» (построение дендрогамм и графиков многомерного шкалирования по двум осям на основе полученных данных) [StatSoft,2001г.].

Сравнение частот специфичностей и трехлокусных гаплотипов в исследованных популяциях проводилось с использованием точного критерия Фишера [Животовский Л.А., 1991г.]. Корректировка на количество аллелей проводилась с помощью коэффициента Бонферонни [Вейр Б., 1995г.].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Особенности распределения специфичностей гена DRB1 в исследованных популяциях.

Данные распределения специфичностей гена DRB1 представлены в табл. 1

При анализе частотного распределения аллелей гена DRB1 среди представителей северной белорусской популяции (Витебская область) выявлено, что самыми частыми аллелями являются DRB1*15 (18,0%), DRB1*13 (16,5%) и DRB1*11 (15,0%), относительно распространенными являются DRB1*07(10,5%), DRB1*01(10,0%), редко встречается DRB1*14(1,0%), не определяются DRB1*09 и DRB1*10. В популяции белорусского Полесья (Брестская область) наиболее частыми представлены следующие аллели - DRB1*15 и DRB1*11 (с частотой 13,3% соответственно), DRB1*13 (11,9%), также отмечается высокое значение DRB1*04 (12,9%). Относительно распространенными являются DRB1*07 и DRB1*01 (10,5% соответственно), редко встречающимися - DRB1*09(1,9%), DRB1*10(0,5%) и DRB1*14(2,9%).

Среди представителей восточного варианта украинской популяции (Хмельницкая область) наиболее распространенными аллелями гена DRB1 являются DRB1*07(14,6%), DRB1*11(18,6%) и DRB1*13(12,4%), относительно распространенными - DRB1*04(10,9%) и DRB1*15(10,2%), менее распространенными - DRB1*09(0,4%), DRB1*10(1,1%), DRB1*12 и DRB1*14 (с частотой 2,2% соответственно). В западном варианте украинской популяции (Львовская область) часто встречаемыми отмечаются аллели DRB1*01(12,2%), DRB1*04(11,3%), DRB1*07(15,2%) и DRB1*11(18,6%), редко встречаемыми - DRB1*09(1,5%), DRB1*12(0,5%) и DRB1*14(2,0%). Остальные аллели по частоте встречаемости занимают промежуточное положение, DRB1*10 не определяется.

Наиболее распространенными аллелями гена DRB1 среди представителей русской популяции (Вологодская область) отмечаются следующие особенности. Наиболее распространенными аллельными вариантами являются DRB1*04(14,0%), DRB1*07(14,9%), DRB1*13(14,9%) и DRB1*15(14,5%), редко встречающимися - DRB1*10(0,4%), DRB1*12(1,2%), DRB1*14(1,2%) и DRB1*16(1,6%). Остальные аллели по частотам имеют промежуточные значения.

Таблица 1. Распределение специфичностей гена DRB1 в исследованных популяциях.

Специфичности DRB1	Белор. сев. (Витебс-кая область), N=100 (%)	Белор. южн. (Брестс-кая область), N=105 (%)	Укр. вост. (Хмельниц-кая область) N=137 (%)	Укр. запад. (Львовс-кая область), N=102 (%)	Русские (Вологод-ская область), N=121 (%)
*01	10,0	10,5	9,5	12,2	12,4
*03	7,0	9,0	5,5	7,8	7,4
*04	7,5	12,9	10,9	11,3	14,0
*07	10,5	10,5	14,6	15,2	14,9
*08	5,5	2,9	3,6	4,4	5,4
*09	0,0	1,9	0,4	1,5	2,5
*10	0,0	0,5	1,1	0,0	0,4
*11	15,0	13,3	18,6	18,6	9,5
*12	4,0	3,8	2,2	0,5	1,2
*13	16,5	11,9	12,4	10,8	14,9
*14	1,0	2,9	2,2	2,0	1,2
*15	18,0	13,3	10,2	9,8	14,5
*16	5,0	6,7	8,8	5,9	1,6

Особенности распределения специфичностей гена DQA1 в исследованных популяциях.

Данные распределения специфичностей гена DQA1 представлены в табл. 2

При анализе частотного распределения аллельных вариантов локуса DQA1 среди представителей белорусских популяций выявлены следующие особенности. Наиболее частыми аллелями в северной популяции (Витебская область) являются DQA1*102(28,5%) и DQA1*501(26,5%), редко встречающимися - DQA1*601(2,0%), остальные аллели по частоте встречаемости занимают промежуточные значения. Среди представителей южной белорусской популяции (Брестская область) отмечаются широко распространенные аллели DQA1*501(29,5%), DQA1*102(19,5%) и DQA1*301(14,8%), редко встречаемые - DQA1*401(2,9%) и неопределяемые - DQA1*601.

При анализе особенностей распределения аллельных вариантов гена DQA1 среди представителей украинских популяций выявлено, что самыми распространенными являются DQA1*0501, DQA1*0102, DQA1*0201 (28,8%, 20,1% и 14,6% соответственно для восточного варианта украинской популяции; 30,4%, 17,7% и 15,2% соответственно для западного варианта). Редко встречается аллель DQA1*0401 (с частотой 2,6% и 2,0% для каждой группы), аллель DQA1*0601 отсутствует в обеих популяциях.

Самыми распространенными аллелями локуса DQA1 у русских являются DQA1*0501(21,1%), DQA1*0102(18,6%) и DQA1*0301(16,9%). Остальные по частотам аллели имеют средние значения, частота аллеля DQA1*0601 имеет наименьшее значение.

Таблица 2. Распределение специфичностей гена DQA1 в исследованных популяциях.

Специфичности DQA1	Белор. сев. (Витебс-кая область), N=100 (%)	Белор. южн. (Брестс-кая область), N=105 (%)	Укр. вост. (Хмельниц-кая область) N=137 (%)	Укр. запад. (Львовс-кая область), N=102 (%)	Русские (Вологод-ская область), N=121 (%)
*101	11,0	13,3	13,5	14,2	14,0
*102	28,5	19,5	20,1	17,7	18,6
*103	10,0	9,5	8,4	5,4	9,0
*201	10,5	10,5	14,6	15,2	14,9
*301	7,5	14,8	12,0	15,0	16,9
*401	4,0	2,9	2,6	2,0	5,0
*501	26,5	29,5	28,8	30,4	21,1
*601	2,0	0,0	0,0	0,0	0,4

 Особенности распределения специфичностей гена DQB1 в исследованных популяциях.

Данные распределения специфичностей гена DQB1 представлены в табл. 3

В локусе DQВ1 в северной белорусской популяции наиболее распространенными выявлены DQВ1*0602-8(31,5%), DQВ1*0301(23,0%) и DQВ1*0201(14,5%), редко распространенными - DQВ1*0304(0,5%), DQВ1*0503(1,0%) и DQВ1*0601(1,5%); DQВ1*0305 не определялся. В популяции белорусского Полесья часто встречаемыми аллелями также являются DQВ1*0602-8(20,0%), DQВ1*0301(22,4%) и DQВ1*0201(17,1%), редко встречаемыми - DQВ1*0304(0,5%), DQВ1*0503(2,9%) и DQВ1*0601(1,9%); DQВ1*0305 также не определялся.

В локусе DQВ1 в восточном варианте украинской популяции (Хмельницкая область) наиболее распространенными аллелями являются DQВ1*0201(18,3%), DQВ1*0301(26,3%) и DQВ1*0602-8(19,0%), менее распространенными - DQВ1*0303(2,6%), DQВ1*0503(2,2%) и DQВ1*0601(0,7%); в западном варианте (Львовская область) самыми распространенными также являются DQВ1*0201(19,6%), DQВ1*0301(23,5%) и DQВ1*0602-8(16,7%); менее распространенными - DQВ1*0401/2(2,0%), DQВ1*0503(1,0%) и DQВ1*0601(0,5%). Аллели DQВ1*0304 и DQВ1*0305 не определяются в обеих популяциях.

В локусе DQB1 в русской популяционной группе часто встречаемые аллели представлены DQB1*0201(17,8%), DQB1*0301(16,1%) и DQB1*0602-8(25,6%), остальные аллели по частотам встречаемости занимают промежуточные положения. Частоты аллелей DQB1*0305, DQB1*0601 имеют наименьшие значения (0,8% и 0,4% соответственно), DQB1*0304 отсутствует в популяции.

Таблица 3. Распределение специфичностей гена DQВ1 в исследованных популяциях.

Специфичности DQB1	Белор. сев. (Витебс-кая область), N=100 (%)	Белор. южн. (Брестс-кая область), N=105 (%)	Укр. вост. (Хмельницкая область) N=137 (%)	Укр. запад. (Львовс-кая область), N=102 (%)	Русские (Вологод-ская область), N=121 (%)
*201	14,5	17,1	18,3	19,6	17,8
*301	23,0	22,4	26,3	23,5	16,1
*302	5,5	9,5	8,0	12,7	11,6
*303	3,0	4,8	2,6	4,9	7,0
*304	0,5	0,5	0,0	0,0	0,0
*305	0,0	0,0	0,0	0,0	0,8
*401/2	4,0	3,3	3,3	2,0	5,0
*501	10,0	10,5	10,6	12,7	12,8
*502/4	5,5	7,1	9,1	6,4	1,6
*503	1,0	2,9	2,2	1,0	1,2
*601	1,5	1,9	0,7	0,5	0,4
*602-8	31,5	20,0	19,0	16,7	25,6

При общем анализе распределения аллельных вариантов DRB1 локуса во всех представленных восточнославянских популяциях можно отметить следующие закономерности. Наблюдается высокие частоты для некоторых аллельных вариантов: DRB1*01, DRB1*07, DRB1*11, DRB1*13 и DRB1*15, что соответствует типичному западно-евразийскому варианту распределения [Terasaki P.I., Gjertson D.W., 1997]. Частота встречаемости аллеля DRB1*04 во всех популяциях колеблется от 8,0% до 14,0%, что соответствует средним значениям в большинстве популяций мира [Terasaki P.I., Gjertson D.W., 1997]. Обращает на себя внимание отсутствие или низкие частоты DRB1*09 и DRB1*12, которые характерны исключительно для монголоидных популяций [Lee J., 1997; Han H. et al., 1997]. В локусе DQA1 для всех исследованных популяций характерны высокие значения встречаемости следующих аллелей: DQA1*0102, DQA1*0201, DQA1*0501. При изучении распределения аллелей гена DQB1 обнаружено, что самыми частыми для всех исследованных популяций (белорусских, украинских  и русских) являются DQB1*0201, DQB1*0301 и DQB1*0602-8.

Сравнительный анализ данных типирования по трем генам HLA – DRB1, DQA1 и DQB1 восточнославянских популяций показал, что основные различия между ними связаны с геном DRB1 и в меньшей степени с DQA1 и DQB1. Объяснением этого факта может служить значительно более выраженный полиморфизм гена DRB1 по сравнению с генами DQB1 и особенно DQA1. Вследствие малой информативности данных, полученных в результате типирования генов DQA1 и DQB1, сравнительный анализ частот их специфичностей не представлен в работе.

При попарном сравнении (0,05 и 0,01 уровни значимости) распределения специфичностей гена DRB1 между исследованными восточнославянскими популяциями было установлено, что достоверно различаются восточные украинцы из Хмельницкой области и русские из Вологодской области частотным содержанием DRB1*11 и DRB1*16, западные украинцы из Львовской области и русские из Вологодской области - частотным содержанием DRB1*11

Особенности полиморфизма генов HLA II класса легли в основу расчета генетических расстояний между изученными популяциями. Расчет генетических расстояний по частотам аллелей DRB1 локуса был проведен по методу М. Нея (Nei, 1974). Дендрограмма, построенная на основе генетических расстояний, представлена на рис. 1

Результаты многомерного статистического анализа выявили, что изученные нами популяции образуют два кластера, соответствующие географической и этногенетической близости популяций. «Южный» кластер включил в себя обе украинские популяции. «Северный» кластер включил обе белорусские (Витебской и Брестской областей) и русскую (Вологодской области) популяции. Неожиданной оказалась несколько большая близость русских Вологодской области к популяции белорусского Полесья, а не к северным белорусам. Сходство популяции русских из Вологодской области с белорусами Полесья может быть связано с существенным генетическим вкладом «южной» колонизации Вологодских земель по сравнению с «северной». А положение на графике северных белорусов может быть связано с влиянием балтских племен, фиксируемые антропологами на севере Белоруссии.

Рис.1 Дендрограмма генетических расстояний на основании частот аллелей DRB1 локуса у представителей восточнославянских популяций

Особенности распределения трехлокусных гаплотипов в исследованных популяциях.

В выборках русских, украинцев и белорусов были определены частоты трехлокусных гаплотипов (DRB1 - DQA1 - DQB1)

Распределение частот трехлокусных гаплотипов в исследованных популяциях показано в табл. 4. Сравнительный анализ представленных данных выявляет наличие общих и индивидуальных особенностей распределения гаплотипов в каждой популяции.

Среди белорусских популяций определяется высокая частота гаплотипов: DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301 и DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8, а также DRB1*01-DQA1*0101-DQB1*0501.

В украинских популяциях отмечается высокие частоты гаплотипов DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301 и DRB1*01-DQA1*0101-DQB1*0501, а также гаплотипа DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201, а среди западных украинцев (Львовская область) выявлена высокая частота гаплотипа DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302.

В русской популяции обнаружены высокие частоты гаплотипов: DRB1*01-DQA1*0101-DQB1*0501, DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8, а также DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302 и DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201.

В среднем наблюдается однотипность частотного распределения трехлокусных гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 у всех представленных популяций. Отличительной особенностью является отсутствие или низкие частоты гаплотипов: DRB1*09-DQA1*0301-DQB1*0303 и DRB1*12-DQA1*0501-DQB1*0301, которые более характерны для монголоидной популяции.

Несмотря на определенную схожесть частотного распределения, в отдельных популяциях отмечается наличие гаплотипов, которые отсутствуют у других, например: в северной белорусской популяции (Витебская область) - DRB1*12-DQA1*0601-DQB1*0301, в полесской популяции (Брестская область) - DRB1*01-DQA1*0102-DQB1*0502/4, DRB1*03-DQA1*0501-DQB1*0301, в восточной украинской популяции (Хмельницкая область) - DRB1*11-DQA1*0103-DQB1*0602-8, DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0502/4, у западных украинцев (Львовская область) - DRB1*09-DQA1*0301-DQB1*0201, DRB1*14-DQA1*0101-DQB1*0501 и DRB1*14-DQA1*0101-DQB1*0502/4, в северной русской популяции (Вологодская область) - DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0305.

Таблица 4. Распределение трехлокусных гаплотипов в исследованных популяциях.

Гаплотипы DRB1-DQA1-DQB1	Белорусы север. (Вит. обл.) N=100 (%)	Белорусы южн. (Брест. обл.) N=105 (%)	Украинцы вост. (Хмел. обл.) N=137 (%)	Украинцы запад. (Львов. обл.) N=102 (%)	Русские (Волог.обл.) N=121 (%)
*01-0101-0501	10,0	10,0	9,5	12,2	12,4
*01-0102-0502/4	0,0	0,5	0,0	0,0	0,0
*03-0501-0201	7,0	8,7	5,5	7,8	7,0
*03-0501-0301	0,0	0,5	0,0	0,0	0,0
*04-0301-0201	0,0	0,5	0,4	0,0	0,0
*04-0301-0301	1,5	1,9	2,9	1,0	1,6
*04-0301-0302	5,5	9,5	7,3	10,3	11,6
*04-0301-0304	0,5	0,5	0,0	0,0	0,0
*04-0301-0305	0,0	0,0	0,0	0,0	0,8
*04-0301-0401/2	0,0	0,5	0,4	0,0	0,0
*07-0201-0201	7,5	7,6	12,4	11,3	10,7
*07-0201-0303	3,0	2,9	2,2	3,9	4,1
*08-0101-0401/2	0,0	0,0	0,4	0,0	0,0
*08-0301-0302	0,0	0,0	0,7	2,4	0,0
*08-0401-0401/2	4,0	2,9	2,5	2,0	5,0
*08-0601-0301	1,5	0,0	0,0	0,0	0,4
*09-0301-0201	0,0	0,0	0,0	0,5	0,0
*09-0301-0303	0,0	1,9	0,4	1,0	2,5
*10-0101-0501	0,0	0,5	1,1	0,0	0,4
*11-0103-0602-8	0,0	0,0	0,4	0,0	0,0
*11-0501-0301	15,0	13,3	18,2	18,6	9,1
*11-0501-0303	0,0	0,0	0,0	0,0	0,4
*12-0501-0301	3,5	3,8	2,2	0,5	1,2
*12-0601-0301	0,5	0,0	0,0	0,0	0,0
*13-0102-0602-8	7,0	0,9	2,2	2,4	2,5
*13-0103-0602-8	8,0	7,6	7,3	4,9	8,7
*13-0301-0301	0,0	0,0	0,0	0,0	0,4
*13-0501-0301	1,0	3,3	2,9	3,4	3,3
*14-0101-0501	0,0	0,0	0,0	0,5	0,0
*14-0101-0502/4	0,0	0,0	0,0	0,5	0,0
*14-0101-0503	1,0	2,9	2,2	1,0	1,2
*15-0102-0502/4	0,5	0,0	0,4	0,0	0,0
*15-0102-0602-8	16,5	11,4	8,8	9,3	14,0
*15-0103-0601	1,5	1,9	0,7	0,5	0,4
*16-0102-0502/4	5,0	6,7	8,8	5,9	1,6

Сравнение частоты трехлокусных гаплотипов в исследованных популяциях.

При попарном сравнении (0,05 и 0,01 уровни значимости) распределения трехлокусных гаплотипов (DRB1-DQA1-DQB1) между исследованными восточнославянскими популяциями было установлено, что достоверно различаются восточные украинцы из Хмельницкой области и русские из Вологодской области частотным содержанием следующих гаплотипов: DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301 и DRB1*16-DQA1*0102-DQB1*0502/4.

Изучение распределения гаплотипических сочетаний показало, что наиболее информативным был сравнительный анализ трехлокусных гаплотипов. Исходя из этого, было бы целесообразным провести сравнение распределения трехлокусных гаплотипических сочетаний в исследованных популяциях с аналогичными данными из литературных источников. Однако данные по трехлокусным гаплотипам в доступной нам литературе практически не были представлены, поэтому в анализ были включены сведения о HLA–профиле некоторых популяций по локусу DRB1 как наиболее полиморфному из исследованных [Terasaki P.I., Gjertson D.W., 1997].

Результаты многомерного кластерного анализа изученных популяций в сравнении с некоторыми народами Европы выявили следующие особенности. Все популяции, представленные на дендрограмме (рис.2), образовали три кластера: «североевропейский», «центрально-европейский» и «южно-европейский». Русские из Вологодской области вошли в «североевропейский» кластер, наряду с немцами, датчанами, голландцами, финнами, ирландцами и англичанами. «Центрально-европейский» кластер включил в себя белорусов, чехов, бельгийцев, австрийцев, швейцарцев, французов, хорватов, украинцев, словаков и венгров. Внутри этого кластера в зависимости от генетической близости популяции распределяются следующим образом: белорусы (Витебская и Брестская области) составляют одну группу с чехами, бельгийцами, австрийцами и швейцарцами, украинцы (Хмельницкая и Львовская области) - со словаками и венграми. В «южно-европейский» кластер вошли болгары, греки и итальянцы.

Те же данные представлены в виде двухмерного графика многомерного шкалирования. (рис.3) Центральное место на графике занимают популяции, составляющие «центрально-европейский» кластер. Северные белорусы (Витебская область) несколько отдалены от основного «ядра» популяций, что, вероятно, обусловлено своеобразием указанной популяционной группы (возможным влиянием балтских племен) или недостаточным размером выборки, взятой для анализа.

С одной стороны к «центрально-европейскому» кластеру примыкают «североевропейские» популяции, из которых ближе всех к центру расположены русские из Вологодской области. Положение русских на графике свидетельствует о сочетании в генофонде указанной группы «североевропейских» и «среднеевропейских» генов. С другой стороны от «ядра» основных популяций расположились «южно-европейские» популяции: болгары, греки и итальянцы.

Подобную картину можно объяснить особенностями расселения и освоения земель древними славянами и историей формирования изученных популяционных групп.

Рис.2 Дендрограмма генетических расстояний на основании частот аллелей DRB1 локуса у представителей восточнославянских популяций и некоторых народов Европы

Рис 3. График многомерного шкалирования генетических расстояний на основе частот гена DRB1 у представителей восточнославянских популяций и некоторых народов Европы.

Бел. сев. – белорусы северные (Витебская область), Бел. южн. – белорусы Полесья (Брестская область), Укр. вост. – украинцы восточные (Хмельницкая область), Укр. зап. – украинцы западные (Львовская область), Рус. – русские (Вологодская область), Болг. - болгары, Хорв. – хорваты, Слов. – словаки, Венг. - венгры, Бельг. – бельгийцы, Австр. – австрийцы, Нем. – немцы, Франц. – французы, Датч. – датчане, Гол. – голландцы, Фин. – финны, Швейц. – швейцарцы, Ирлан. – ирландцы, Англ. – англичане, Итал. - итальянцы

Представленный в этой работе анализ полиморфизма аллелей генов HLA можно рассматривать как часть популяционных исследований, проводимых среди восточнославянских этносов: антропологические исследования, анализ митохондриальных и Y-хромосомных, а также других аутосомных маркеров ДНК. Наиболее полная информация по восточнославянским народам была получена в ходе нескольких антропологических экспедиций: «Русской антропологической экспедиции» (В.В. Бунак, 1965), «Украинской  и Прибалтийской антропологических экспедиций» (Дьяченко, 1965, Витов, Чебоксаров, 1959). Для исследований были использованы следующие методы: оценка антропологических признаков (размеры головы и лица, показатели цвета волос и глаз, интенсивности роста бороды, форма носа), дерматоглифика, география фамилий и т.п. Ареал славянских народов находится в рамках той обширной зоны, которая разделяет ареалы северных и южных европеоидов, выделяющихся, в пределах европеоидной расы, максимально светлой и максимально темной пигментацией. Население этой переходной зоны отличается большим разнообразием локальных сочетаний антропологических признаков.

Принято объединять эти локальные варианты в две группы – западноевропейскую и центрально-восточноевропейскую. На территории Восточной Европы распространены, в основном, четыре расы: среднеевропейская, альпо-карпатская, индо-средиземноморская и лапоноидная. Каждая из них, за исключением лапоноидной, представителями которой являются саамы, представлена рядом антропологических типов. На крайнем востоке Европы у многих из этих типов проявляется древняя уралоидная примесь, которая может сочетаться с понтийским компонентом (характерным для южных европеоидов), а также - с относительно недавним влиянием южно-сибирской монголоидности.

На северо-западе Восточной Европы по побережью Балтики среднеевропейская раса включает атланто-балтийский компонент. В беломоро-балтийской зоне черты северных европеоидов сочетаются с определенным уралоидным компонентом. У восточнославянских народов наиболее заметно присутствуют черты среднеевропейской расы. На юго-западе расселения восточных славян присутствует заметное участие альпо-карпатского компонента. На юге и юго-востоке – понтийского, который может быть отмечен у болгар и албанцев, живущих на Украине; на востоке – субуральского, на севере – беломоро-балтийского [Алексеева Т.И., 1999].

В настоящее время широко используется относительно новый метод - геногеография, где для анализа используются генетически наследуемые мало полиморфные системы, в частности система ABO, некоторые биохимические маркеры. Информация о генофонде населения Восточной Европы содержит данные из литературных источников, опубликованных с 1985 по 1995 гг. Геногеография народонаселения способна напрямую связывать генетическую действительность современных поколений с древностью. В результате исследования было обнаружено, что из всех воздействий на генофонд за все время существования населения Восточной Европы главное формообразующее значение имели воздействия в направлении запад-восток. Они носили характер проникновения с запада – юго-запада и распространения по Восточной Европе генных комплексов европейского и балканского происхождения и их носителей – древних народов и племен. Население Восточной Европы постепенно и достаточно равномерно генетически становилось европейским, но эта генетическая «европеизация» не дошла до конца. Возникло некое равновесие между европейскими и азиатскими влияниями, возникло своего рода евразийское равновесное состояние генофонда народов Восточной Европы [Алексеева Т.И., 1999].

Несмотря на то, что типирование генов HLA – относительно новый подход, создающий новые возможности в оценке генетического профиля популяций, трудно сравнивать результаты, представленные в этой работе, с данными анализа других генетически наследуемых факторов, полученными в ходе многолетних исследований из-за разницы в количестве обследованных популяционных групп. Тем не менее, даже такое небольшое количество изученных популяций отражает основные закономерности геногеографического взаиморасположения исследованных восточнославянских групп. В результате этого можно заключить, что, несмотря на влияние естественного направленного отбора, система генов HLA сохраняет свое разнообразие, приуроченность различных вариантов её генов к определенным этническим группам и адекватно отражает геногеографию различных популяций, и, следовательно, может быть использована в популяционных исследованиях.

ВЫВОДЫ:

1.       Самыми частыми аллельными вариантами DRB1 гена для всех изученных популяций являются: DRB1*07, *11, *13, *15, что соответствует западно-евразийскому типу распределения.

2.       При попарном сравнении распределения специфичностей гена DRB1 между восточными украинцами и русскими выявлены достоверные различия в частотном содержании DRB1*11 и DRB1*16.

3.       При попарном сравнении распределения аллелей гена DRB1 выявлено, что западные украинцы достоверно отличаются от русских частотным содержанием DRB1*11.

4.       Сравнительный анализ представленных данных отмечает, что у всех популяций часто встречаемыми являются следующие трехлокусные гаплотипы: DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301, DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8, DRB1*01-DQA1*0101-DQB1*0501, DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302 и DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201

5.       Отличительной особенностью является отсутствие или низкие частоты гаплотипов: DRB1*09-DQA1*0301-DQB1*0303 и DRB1*12-DQA1*0501-DQB1*0301

6.       При попарном сравнении частот распределения трехлокусных гаплотипов (DRB1-DQA1-DQB1) восточных украинцев с русскими было установлено, что достоверными являются различия в частотном содержании DRB1*11-DQA1*0501-DQB1*0301 и DRB1*16-DQA1*0102-DQB1*0502/4.

7.       Результаты многомерного статистического анализа выявили, что изученные популяции образуют два кластера»: «южный», включающий украинцев (Хмельницкая и Львовская области), и «северный», включающий белорусов (Витебская и Брестская области) и русских из Вологодской области.

8.       При проведении многомерного кластерного анализа изученных популяций и некоторых народов Европы выявлено, что белорусы из Витебской и Брестской областей и украинцы из Хмельницкой и Львовской областей генетически близки с «центрально-европейскими» популяциями. Русские из Вологодской области сходны по HLA–профилю с «североевропейскими» и «центрально-европейскими» популяциями.

9.       На примере восточных славян показано, что, несмотря на влияние естественного направленного отбора, система генов HLA адекватно отражает геногеографию этих этнических групп, и может быть использована в популяционных исследованиях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Данные о распределении специфичностей генов HLA II класса и их сочетаний у здоровых представителей белорусских, украинских и русской популяций могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний.

Данные особенностей распределения специфичностей генов HLA II класса, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями, могут быть использованы для прогнозирования характера распространенности этих заболеваний среди восточнославянских популяций

Полученные данные могут служить теоретической базой для практических рекомендаций по качественному и количественному составу регистров доноров аллогенного костного мозга в различных регионах нашей страны.

Популяционные данные могут быть использованы в судебно-медицинской практике для идентификации личности.

Полученные данные могут быть использованы в антропогенетических исследованиях для изучения истории формирования народов Евразии.

Данные могут быть использованы в учебном процессе при проведении лекций и практических курсов по иммунологии и медицинской генетике для студентов медико-биологических специальностей

ХРОМОВА

НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА

ПОЛИМОРФИЗМ СИСТЕМЫ HLA У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗНЫХ СЛАВЯНСКИХ ЭТНИЧЕСКИХ ГРУПП (РУССКОЙ, БЕЛОРУССКОЙ И УКРАИНСКОЙ)

14.00.36 – Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва, 2006 г.

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России»

Научный руководитель:                 кандидат медицинских наук

Болдырева М.Н.

Официальные оппоненты:           доктор медицинских наук, профессор

   Ярилин А.А.

                                                        доктор медицинских наук, профессор

Бубнова Л.Н.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится “ 28 ”февраля 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп. 2. Факс: (095) 117-10-27.

                                                                          

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России».

Автореферат разослан “ 26 ” января 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук                                                       Л.С. Сеславина

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хромова Н.А., Болдырева М.Н., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э., Атраментова Л.А., Ищук М, Тегако О.В., Алексеев Л.П., Балановская Е.В. Изучение особенностей распределения аллелей DRB1 локуса и трехлокусных гаплотипов среди представителей восточнославянских популяций. // Медицинская генетика. – 2006. – том 5, №6, с. 21-25.

2. Болдырева М.Н., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Балановская Е.В., Балановский О.П., Пшеничнов А.С., Целинская И.Н., Кашенин М.Н., Ганичева Л.Л., Поздеева О.С., Евсеева И.В., Сароянц Л.В. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. I. Русские. // Иммунология. - 2005. - №5, том 26, с. 260-263.

3. Болдырева М.Н., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Ганичева Л.Л., Поздеева О.С., Балановская Е.В., Алексеев Л.П. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. II. Народы европейской части. // Иммунология. - 2006. – том 27, №.4, с. 198-202.

4. Болдырева М.Н., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Кабдулова Д.Д., Евсеева И.В., Осокина И.В., Алексеев Л.П. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. III. Народы Евразии. // Иммунология. – 2006. - том 27, № 6, с. 324-329.