| Разноцветные «чудеса» науки
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Несколько столетий назад началась одна из самых интересных и красивых историй — история изучения цвета у растений. В ходе изучения растительных пигментов были сделаны важнейшие открытия современной биологии (законы Менделя, мобильные генетически элементы, явление РНК-интерференции). На сегодняшний день вопросы о биохимической природе пигментов растений, их биосинтезе и его регуляции достаточно подробно исследованы. А полученные данные активно применяются учёными для манипуляций с цветом у растений.
| |||||||||||||||||||||||||||||
Эта работа заняла первое место в номинации «приз зрительских симпатий» конкурса «био/мол/текст»-2012.
Спонсор конкурса — дальновидная компанияLife Technologies.
Оглавление
В последнее время как в российских, так и в зарубежных СМИ появляются сообщения о «чудо-фруктах», «чудо-овощах» и «чудо-цветах» с необычной окраской, которая либо не встречается у данных видов растений, либо встречается, но очень редко. Так, например, немалый фурор среди российской общественности произвела новость о создании уральскими селекционерами сорта картофеля «Чудесник» с фиолетовой окраской мякоти (рис. 1,слева).
И хотя на российском рынке фиолетовая морковь и перец являются чем-то необычным и очень редким, за рубежом овощами с фиолетовой окраской уже никого не удивить (рис. 1, в центре). Среди «чудес» науки, которые поражают воображение многих людей, можно упомянуть голубые розы (рис. 1, справа), впервые созданные в 2004 году австралийской компанией Флориген (Florigene) при поддержке японского холдинга Сантори.
Приведенные примеры растений с необычной для нас окраской различных органов объединяет то, что все они были искусственно созданы человеком с помощью манипуляций с окраской, которая обусловлена растительными пигментами — антоцианами. Однако без всестороннего исследования природы антоциановой окраски и генетической составляющей биосинтеза антоциановых соединений манипуляция с окраской у различных видов растений была бы невозможна.
Рисунок 1. Растения экзотических цветов. Слева: Клубень картофеля сорта «Чудесник», выведенного сотрудниками Уральского научно-исследовательского института сельского хозяйства. Фото: Вести-Урал. В центре: Морковь с пурпурной окраской корнеплода на рынке в Турции. Фото: Turkey’s for life. Справа: Первая в мире «синяя» роза, созданная австралийскими учеными из компании Флориген (Florigene) при поддержке японского холдинга Сантори.
Что такое антоцианы? Несколько слов о химии
На сегодняшний день достаточно хорошо исследованы такие растительные пигменты, как флавоноиды, каротиноидыи беталаины; они имеют различную химическую структуру и придают растениям различную окраску. И хотя каротиноиды и беталаины тоже очень интересные пигменты, в данной статье мне бы хотелось остановиться на пигментах флавоноидной природы, поскольку именно они обусловливают огромное разнообразие оттенков цветов у растений. К данной группе относятся повсеместно распространенные среди цветковых растений антоцианы, которые не только окрашивают растения в розовые, красные, оранжевые, алые, пурпурные, голубые, темно-синие цвета, но и являются очень полезными для человека биологически активными молекулами [1]. И хотя другие флавоноидные соединения также могут участвовать в образовании цвета у растений (например, ауроны обеспечивают желтую окраску, а бесцветные флавонолы стабилизируют антоциановые пигменты), основное внимание в статье будет уделено именно антоцианам.
Рисунок 2. Базовая структура антоцианидинов и антоцианов. Представлена нумерация атомов углерода.
Итак, антоцианы — это растительные пигменты, которые могут присутствовать у растений в генеративных (цветках, пыльце) и вегетативных (стеблях, листьях, корнях) органах, а также в плодах и семенах [2]. При этом данные соединения могут либо постоянно присутствовать в клетке, либо появляться на некоторое время на определенной стадии развития растений или при действии стресса. Последнее обстоятельство навело ученых на мысль, что данные соединения нужны не только для окраски цветов и плодов для привлечения насекомых-опылителей и распространителей семян, но и для борьбы с различными типами стрессов [3].
Первые опыты по изучению антоциановых соединений и их химической природы были проведены известным английским химиком Робертом Бойлем еще в 1664 г., когда он впервые обнаружил, что под действием кислот синий цвет лепестков василька изменялся на красный, под действием же щелочи лепестки зеленели [4]. В
Все антоцианы (которых известно более 500, и число это растет [5]) имеют общий С15-углеродный скелет, образованный двумя бензольными кольцами А и В, соединенными С3-фрагментом. При этом от других флавоноидных соединений антоцианы отличаются наличием положительного заряда и двойной связи в С-кольце (рис. 2). Несмотря на огромное разнообразие антоциановых соединений, все они представляют собой производные шести основных антоцианидинов: пеларгонидина, цианидина, пеонидина, дельфинидина, петунидина и мальвидина, которые отличаются боковыми радикалами R1 и R2 (рис. 2, табл. 1). Поскольку при биосинтезе (о нем речь пойдет чуть ниже) пеонидин образуется из цианидина, а петунидин и мальвидин — из дельфинидина, можно выделить три основных антоцианидина: пеларгонидин, цианидин и дельфинидин, которые, таким образом, являются предшественниками всех антоциановых соединений.
Имея общее строение С15-углеродного скелета, индивидуальные соединения в классе антоцианов выделяют на основе наличия, положения и характера модификаций основного С15-углеродного скелета. В качестве примера строения индивидуального соединения антоциана с модификациями А-, В- и С-колец на рисунке 3 приведена структура так называемого «небесно-синего антоциана», который придает растениям ипомеи голубую окраску.
Рисунок 3. Структура «небесно-синего антоциана» (C08642).Соединение выделено из Ipomoea tricolor. На рисунке отмечены: синим — пеонидин (метилированное производное цианидина); зеленым — остатки кофейной кислоты; черным — остатки глюкозы. Картинка: Schröder Group.
Рисунок 4. Поперечный cрез корней горчицы, росших в среде с молибденом (+Мо) и без него (−Мо). Данный вид растения накапливает антоцианы в эпидермисе корня, которые с ионами молибдена образуют комплексы, меняя при этом цвет с пурпурного на синий.Рисунок из [6].
Какую именно окраску будет иметь растение, зависит от многих факторов:
Существует такая закономерность: голубой (синий) цвет имеет дельфинидин и его производные, красно-оранжевую окраску имеют производные пеларгонидина, а пурпурно-красную — цианидина. При этом голубой цвет обусловливают гидроксильные группы (табл. 1, рис. 3), метилирование которых (присоединение группы —CH3) приводит к «покраснению» [7]. Однако следует учитывать, что одно и то же антоциановое соединение в зависимости от сдвига в величине кислотности клеточного сока может приобретать различные оттенки. Так, раствор антоцианов в кислой среде имеет красный, в нейтральной — пурпурный, а в щелочной — желто-зелёный цвет (рис. 5).
Рисунок 5. Изменение окраски раствора антоцианов, выделенных из краснокочанной капусты, при изменении рН раствора от 1 до 10 (слева направо). Фото: Fundamental Photographs.
Итак, чем обусловлены оттенки антоциановой пигментации, почему они разные у разных видов растений, или даже у одних и тех же растений в разных условиях произрастания, становится ясно. Вооружившись уже изложенными данными, каждый читатель может сам поэкспериментировать со своими домашними растениями, понаблюдав за изменением их окраски. Однако, если в ходе этих экспериментов вы добьетесь желаемого оттенка цвета и ваше растение выживет, то уже точно оно не передаст данный оттенок своим потомкам. Чтобы эффект был стойким, необходимо разобраться еще в одном аспекте формирования цвета, а именно в генетической составляющей биосинтеза антоцианов в клетках растений.
Молекулярно-генетические основы биосинтеза антоцианов
Данный вопрос исследован на сегодняшний день достаточно полно, чему немало поспособствовали мутанты различных видов растений с нарушенным биосинтезом антоцианов. Было установлено, что на биосинтез антоцианов (а, следовательно, и на формируемый оттенок у растения) влияют мутации в трех типах генов [8]:
Благодаря методам биохимии и молекулярной генетики все стадии биосинтеза антоцианов и осуществляющие их ферменты на сегодняшний день известны и достаточно полно исследованы (рис. 6), в том числе из многих видов растений выделены структурные и регуляторные гены биосинтеза антоцианов [8]. Знание особенностей биосинтеза антоциановых пигментов у конкретного вида растения позволяет проводить манипуляции с его окраской на генетическом уровне, создавая растения с необычной пигментацией, которые будут передавать новые признаки окраски из поколения в поколение.
Рисунок 6. Биосинтез антоцианидинов: цианидина, пеларгонидина, дельфинидина. Антоцианидины далее подвергаются реакциям модификации (гликозилированию, ацилированию, метилированию), которые осуществляются гликозилтрансферазами (GT), ацилтрансферазами (AT) и метилтрансферазами (MT). Типичная окраска, которую имеют антоцианы, образующиеся из приведенных антоцианидинов, представлена на рисунке, но она зависит от многих факторов: pH, ко-пигментации с бесцветными флавоноидами, комплексами с ионами тяжелых металлов. Заметьте, что метилированию В-кольца (синие прерывистые стрелки) подвергаются антоцианы, а не антоцианидины. Аббревиатуры: халконсинтаза (CHS); халконфлаванонизомераза (CHI); дигидрофлавонол
Подходы и «горячие точки» для модификации цвета у растений
В связи с вышеизложенным «горячими точками» для модификации цвета у растений в основном являются структурные и регуляторные гены. Гены, кодирующие транспортеры, также используются для изменения цвета, но не так часто, как две другие группы генов.
Подходы, с помощью которых можно модифицировать окраску растений, делятся на два типа. К первому типу относятся подходы на основе методов селекции, позволяющие ввести гены от доноров — растений близкородственного вида, имеющих нужный признак. По славам авторов «Чудесника», именно методом селекции был создан этот сорт (рис. 1, слева). Ещё один яркий пример — это пшеница с пурпурным и голубым цветом зерна, обусловленным антоцианами (рис. 7).
Рисунок 7. Пурпурное (слева), голубое (справа) и неокрашенное (в центре) зерно пшеницы. Фото:MetroNews.
В дикой природе пшеница с пурпурным зерном впервые была обнаружена в Эфиопии (где, по всей видимости, и появился данный признак), а потом гены, которые обусловливают этот признак, были введены методами селекции в возделываемые сорта мягкой пшеницы [10]. Пшеница с голубым зерном в природе не встречается, но зато голубое зерно имеет родственник пшеницы — пырей. Скрещивая пырей и пшеницу и ведя отбор по данному признаку, селекционеры получили пшеницу с голубым зерном, как у пырея [10]. В вышеназванных примерах в геном пшеницы были введены регуляторные гены. То есть, пшеница и так имеет функциональный аппарат биосинтеза антоцианов (все ферменты необходимые для биосинтеза в порядке), а, вводя методами селекции регуляторные гены от родственных видов, у пшеницы запускают машину биосинтеза антоцианов именно в зерне.
Схожий пример, но уже с использованием второй группы методов манипуляции с окраской — методов генетической инженерии: были получены томаты с повышенным содержанием антоцианов [11]. В норме спелые томаты содержат каротиноиды, в том числе жирорастворимый антиоксидант ликопин; из флавоноидов в них есть небольшое количество нарингенина халкона (2’,4’,6’,4-тетрагидроксихалкон, см. рис. 6) и рутина (гликозированный 5,7,3’,4’-тетрагидрооксифлавонол). Вводя в растения томата генетическую конструкцию, содержащую регуляторные гены биосинтеза антоцианов львиного зева Ros1 и Del под управлением промотора E8, активного в плодах томата, авторам удалось получить томаты с высоким содержанием антоцианов (рис. 8). Таким образом, запустить «машину» биосинтеза антоцианов в определенной ткани можно посредством манипуляции с регуляторными генами, которую проводят либо методами селекции, либо методами генетической инженерии.
Рисунок 8. Томаты с повышенным содержанием антоцианов в плодах, полученные методом генетической инженерии [11].
Пример использование генетической инженерии, для манипуляций с окраской за счет структурных генов биосинтеза антоцианов — пионерская работа, проведенная на петунии [12]. В этой работе впервые в истории были применены методы генетической инженерии с целью изменения окраски растений. В норме растения петунии вовсе не содержат пигментов, производных от пеларгонидина (рис. 6). Это связано с тем, что для фермента DFR (дигидрофлавонол
Совершенно другая картина субстратной специфичности фермента DFR наблюдается у кукурузы, DFR которой предпочтительнее использует дигидрокемпферол в качестве субстрата [13]. Вооружившись этими знаниями, Мейер с коллегами использовали мутантную линию петунии, у которой отсутствовали функциональные ферменты F3’Н и F3’5’H. Глядя на рисунок 6, нетрудно заметить, что данная мутантная линия накапливала дигидрокемпферол, который не является субстратом для DFR петунии, но зато является субстратом для DFR кукурузы. Введя в мутантную линию генетическую конструкцию, содержащую ген Dfr кукурузы, Мейер получил петунию с несвойственной для неё кирпично-красной окраской цветков (рис. 9).
Рисунок 9. Слева: мутантная линия петунии с бледно-розовой окраской венчика из-за присутствия следовых количеств антоцианов — производных цианидина и дельфинидина. Справа: генетически модифицированная петуния, накапливающая антоцианы — производные пеларгонидина. Рисунок из [12].
Однако не всегда у исследователей под руками есть такие удобные мутанты с отсутствием какой-либо ферментативной активности, поэтому наиболее часто при модификации окраски растений приходится её «выключать» и «включать» другую, требуемую активность. Именно такой подход был реализован при создании первой в мире розы с синей окраской бутонов (рис. 1, справа), схема создания которой приведена на рисунке 10.
Рисунок 10. Схема создания синей розы.
Рисунок 11. Схема биосинтеза антоцианов и ауронов.Снизу приведены цветки обычной, накаливающие антоцианы (слева), и трансгенной торении, накапливающие ауроны (справа). THC — тетрагидроксихалкон, PHC — пентагидроксихалкон. Рисунок из [14] c модификациями.
У роз, созданных усилиями селекционеров, окраска лепестков варьирует от ярко-красных и нежно-розовых до жёлтых и белоснежных. Интенсивное изучение биосинтеза антоцианов у роз позволило установить, что они не имеют F3’5’H-активности, а фермент DFR розы использует в качестве субстратов дигидрокверцетин и дигидрокемпферол, но не дигидромирицетин (рис. 6). Поэтому при создании синей розы учёные выбрали следующую стратегию.
При этом, чтобы F3’5’H анютиных глазок и F3’H розы не конкурировали друг с другом за субстрат (оба фермента используют в качестве субстрата дигидрокемпферол, рис. 6), для создания синей розы был выбран доступный генотип с отсутствием F3’H активности.
Еще одни яркий пример использования накопленных данных о биосинтезе флавоноидных пигментов с целью создания растений с несвойственной для них окраской — это получение методами генетической инженерии растений торении с жёлтой окраской цветков (рис. 11).
Известно, что жёлтую окраску имеют два типа пигментов: ауроны (класс пигментов флавоноидной природы, которые обусловливают яркую жёлтую окраску цветков львиного зева и георгин), и каротиноиды (пигменты цветков томатов и тюльпанов). В ходе анализа биосинтеза ауронов у львиного зева было установлено, что данные пигменты синтезируются из халконов посредством двух ферментов — 4’CGT (4’-халконгликозилтрансферазы) и AS (ауреузидинсинтазы) (рис. 11). Введение генетических конструкций с генами 4’Cgt и As львиного зева в растения торении, в норме имеющие синюю окраску цветков, совместно с ингибированием биосинтеза антоциановых пигментов привело к накоплению ауровнов и, следовательно, к яркой жёлтой окраске цветков (рис. 11). (Читатель самостоятельно может предположить, на уровне работы каких ферментов может быть заблокирован биосинтез антоцианов в этом случае.) Разработанная специалистами стратегия может быть использована для получения желтой окраски цветков не только у торении, но и у герани и фиалки [14].
Приведенные примеры — это лишь малая доля того, какие манипуляции ученые проводят с тем, что им очень хорошо известно — с биосинтезом антоцианов.
Заключение
Как видно, огромному успеху в манипуляции с окраской у растений способствует интенсивное исследование биохимической природы пигментов, а также особенностей их биосинтеза у различных видов растений — как на уровне ферментов, так и на молекулярно-генетическом уровне. Накопленный к настоящему времени багаж знаний об антоциановых соединениях открыл неисчерпаемые возможности для создания декоративных растений с необычной окраской, а также культурных видов растений с повышенным содержанием антоциановых пигментов. И хотя достижения селекции — необычно окрашенные овощи и фрукты — уже сейчас доступны покупателям в ряде стран, декоративные растения, созданные методами генетической инженерии, в большинстве своем на рынке являются ещё достаточно редкими. Дело в том, что из-за ряда нерешенных трудностей — таких, например, как стабильность наследования модифицированной окраски, — они ещё не коммерциализированы (за исключением некоторых сортов петунии, синей розы, лиловой гвоздики). Однако работа в этом направлении продолжается. Будем надеяться, что в скором времени появятся радующие глаз «чудеса» науки, которые будут доступны всем любителям прекрасного.
Литература
| ||||||||||||||||||||||||||||||
воскресенье, 22 декабря 2013 г.
Разноцветные «чудеса» науки
