Секвенирование

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от англ. sequence — последовательность). В результате получается линейное символьное описание, которое сжато поясняет атомную структуру молекулы.^[1][2]

Для секвенирования применяются методы Эдмана, Сэнгера и другие; в настоящее время для секвенирования нуклеиновых кислот обычно применяется метод Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР.

Содержание    1 Секвенирование по Сэнгеру 2 См. также 3 Примечания 4 Литература

Секвенирование по Сэнгеру

Основная статья: Метод Сэнгера

Участок геля, меченного радиоактивным изотопом

Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При дидезокси-секвенировании происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице.

Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается.

В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез.^[3]

См. также

• Метод Эдмана
• Бисульфитное секвенирование
• Пиросеквенирование

Примечания

1. ↑ Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: в трех томах — 2. — Москва: Мир, 1994. — Т. 1. — 517 с. — 10000 экз. — ISBN 5030019855.
2. ↑ Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия — 3. — Москва: Высшая школа, 2000. — 479 с. — 7000 экз. — ISBN 5060037207.
3. ↑ Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

Литература

• Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.