МУТАЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС В ЭВОЛЮЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

Б. А. Малярчук

Институт биологических проблем Севера, Дальневосточное отделение РАН, Магадан

Рассмотрена проблема возникновения мутаций в митохондриальном геноме человека. С помощью филогенетического анализа изменчивости митохондриальной ДНК (мтДНК) впервые реконструи­рованы мутационные спектры ГВС1 и ГВС2. Обоснован методический подход к выявлению гипер­вариабельных позиций главной некодирующей области мтДНК, по вариабельности выделены клас­сы нуклеотидных позиций. Методами контекстного анализа ДНК определены основные механизмы генерирования мутаций в "горячих" точках мтДНК. Впервые сформулированы представления о преобладании контекст-зависимых механизмов возникновения мутаций в митохондриальном гено­ме человека.

Митохондрии - исключительно важные органеллы клетки, отвечающие за производство энергии в форме АТФ. Помимо этого, согласно последним данным, они участвуют в апоптозе и играют ключевую роль в отборе половых клеток при оплодотворении [30, 43, 67]. Исследования ге­нетических особенностей митохондрий и измен­чивости мтДНК человека и животных, выполнен­ные за последние десятилетия, продемонстриро­вали широкие возможности этой генетической системы для получения новой информации об эволюционной и популяционной истории видов. Исследования изменчивости митохондриального генома человека позволили существенно расши­рить наши представления об эволюции человека, происхождении народов, молекулярных основах ряда наследственных заболеваний и процессах старения.

В то время как хромосомные гены представле­ны двумя копиями на клетку и наследуются в со­ответствии с законами Менделя, митохондриальные гены находятся в цитоплазматических органеллах, присутствуют в сотнях и тысячах копий на клетку и наследуются строго по материнской ли­нии [31]. Материнский тип наследования мтДНК и отсутствие рекомбинации между молекулами приводят к эволюции митохондриальных гено­мов посредством последовательного накопления мутаций из поколения в поколение и стохастиче­скому распределению мутантных форм мтДНК в процессе клеточных делений [31, 84]. В связи с этим мтДНК представляет собой достаточно про­стую генетическую систему для изучения макро-и микроэволюционных процессов. Важное свойство ДНК митохондрий - высо­кий уровень изменчивости. Известно, что мито-хондриальный геном накапливает соматические мутации в течение всей жизни человека [84]. По мере старения в различных тканях (скелетных мышцах, мозге, сердце) наблюдается увеличение количества делеций и  других мутаций мтДНК [85]. В среднем количество мутантной мтДНК в клетках довольно мало (<2%), однако, индивиду­альные клетки могут содержать высокие уровни мутантной ДНК определенного типа [13]. Превы­шение критического уровня таких молекул мтДНК в клетках (обычно этот уровень составля­ет 50-60%), как правило, уже приводит к дефек­там в системе окислительного фосфорилирования митохондрий [84]. 

Начиная с первых исследований изменчивости мтДНК в популяциях человека и животных, было обнаружено, что митохондриальные гены, коди­рующие белки, характеризуются повышенной (в 5-10 раз) изменчивостью по сравнению с генами ядерного генома [15]. Между тем, популяционные данные об изменчивости нуклеотидных последо­вательностей полных митохондриальных гено­мов человека показывают, что минимальная ва­риабельность характерна для генов тРНК и рРНК, в то время как изменчивость нуклеотидов в третьих позициях кодонов и гипервариабельном сегменте 1 превышает таковую для генов РНК в 4 и 20 раз, соответственно [28]. По данным [39], изменчивость главной некодирующей области мтДНК человека в 20 раз выше, чем остальной части генома.

Скорость эволюции является функцией двух переменных - мутационной скорости и доли му­таций, зафиксированных в геноме [15], т.е. высо­кая скорость эволюции мтДНК может объяс­няться либо повышенной скоростью накопления мутаций, либо более высокой интенсивностью фиксации мутаций, либо (что более вероятно) взаимодействием обоих параметров. Предполо­жение о повышенной скорости накопления мута­ций в мтДНК возникло давно [14], остается в силе до настоящего времени и подтверждается новы­ми данными по изменчивости мтДНК у различ­ных животных.

Мутационные процессы в мтДНК имеют неко­торые особенности. Это, во-первых, выраженное смещение мутационного спектра мтДНК в сторо­ну транзиций, что может свидетельствовать об усиленном мутационном давлении [81], во-вто­рых, существенное (в 4-6 раз) превышение скоро­сти накопления молчащих замен по отношению к смысловым заменам в мтДНК, что может указы­вать на высокую скорость фиксации нейтраль­ных мутаций в мтДНК [42].

Основными факторами, способствующими увеличению скорости накопления мутаций в митохондриальных геномах, принято считать влия­ние на мтДНК продуктов окислительно-восста­новительных реакций, интенсивно проходящих в митохондриях, несовершенство процесса репли­кации мтДНК, приводящего к ошибкам и отсут­ствие эффективной системы репарации ДНК в митохондриях.

окислительно-восстановительные реакции в митохондриях, модифицированные основания ДНК И МУТАГЕНЕЗ 

Высокий уровень мутагенеза мтДНК может быть обусловлен в значительной мере окисли­тельно-восстановительными процессами, катали­зируемыми ферментами дыхательной цепи и сис­темы окислительного фосфорилирования мито­хондрий. Экспериментально показано, что ряд химических соединений оказывает влияние пре­имущественно на митохондриальный геном, а не на ядерную ДНК. Так, воздействие на крыс этил-нитрозомочевиной приводит к двукратному уве­личению уровня О⁶-этил гуанина в мтДНК [75]. Появление высокого уровня алкилированных ос­нований мтДНК млекопитающих является резуль­татом воздействия таких реагентов как N-метил-N-нитрозомочевина и N-нитрозодиметиламин [62]. Ряд полициклических ароматических соединений бензопиренового ряда также влияет преимущест­венно на мтДНК [11]. Как ни странно, в экспери­ментальных системах (например, в клетках HeLa) химические мутагены практически не приводят к повышению уровня митохондриальных мутаций [60]. Напротив, согласно данным исследований ин­дуцированного мутагенеза мтДНК эмбриональ­ных клеток почек человека воздействие УФ-излучения индуцирует митохондриальные мутации (преимущественно транзиции G → A) [65]. Ранее была обнаружена высокая скорость на­копления модифицированных оснований мтДНК, обусловленная воздействием перекиси водорода, супероксидных и гидроксильных радикалов, появ­ление которых связано с процессом аэробного ме­таболизма митохондрий [37, 72]. В этой связи ос­новными источниками эндогенного мутагенеза. Ранее была обнаружена высокая скорость на­копления модифицированных оснований мтДНК, обусловленная воздействием перекиси водорода, супероксидных и гидроксильных радикалов, появ­ление которых связано с процессом аэробного ме­таболизма митохондрий [37, 72]. В этой связи ос­новными источниками эндогенного мутагенеза  мтДНК считаются окислительно-восстановитель­ные реакции, спонтанный гидролиз и реакции дезаминирования и метилирования ДНК. Извест­но, что в митохондриях находится примерно 90% клеточного кислорода, из них 2% конвертируется в супероксидные радикалы [12]. Супероксиды вызывают появление в митохондриях окислен­ных форм пуриновых и пиримидиновых основа­ний ДНК. Наиболее распространенным является 8-оксо-7,8-дигидродеоксигуанин (8-OH-dG). В ря­де исследований показано, что 8-OH-dG накап­ливается в мтДНК со скоростью от 1 х 10^-7 до 1.3 х 10^-4 аддуктов на пару нуклеотидов [58, 72]. Важно отметить, что 8-OH-dG индуцирует в мтДНК преимущественно трансверсии G → T [47]. В том случае, когда при репликации ДНК 8-OH-dG ис­пользуется в качестве нуклеотидного субстрата, генерируются трансверсии A → C [18].

Другой возможный продукт окислительных реакций ДНК в митохондриях - 5-гидроксицито-зин (5-OH-dC). Показано in vitro, что в ДНК он ин­дуцирует преимущественно транзиции G  → A [27], однако, наличие 5-OH-dC в клетках человека точно не установлено.

Еще один потенциальный механизм мутагене­за мтДНК связан с дезаминированием цитозина [1, 16, 29]. Известно, что дезаминирование цитозина приводит к накоплению в ДНК урацила, вследствие чего при репликации во вновь синте­зированных цепях ДНК происходит встраивание комплементарного основания аденина. Эволюция ДНК, входе которой происходит смещение нуклеотидного состава в сторону A + T, может быть следствием отсутствия механизмов репарации дезаминированного цитозина или особенностей ДНК-полимераз, более эффективно использую­щих при репликации A и T [40]. Превращение цитозина в урацил вследствие реакции дезаминирования приводит к транзициям C →  и G → A, что выявлено для различных ДНК-полимераз многих организмов [48]. Исследования [29] показа­ли, что интенсивность дезаминирования остатков цитозина в урацил с последующим генерировани­ем транзиций C → T зависит от длительности пребывания участков H-цепи в одноцепочечном состоянии на стадии репликации мтДНК и, соот­ветственно, от расстояния до OriH, и она тем выше, чем ближе участок мтДНК расположен к OriH.

Другим источником транзиций C→T/G→ A в мтДНК млекопитающих (грызунов, человека) является гидролитическое дезаминирование 5-метилцитозина [63]. В исследованиях [23] показано, что в мтДНК метилированы 0.6-6% остатков цитозина, а скорость дезаминирования 5-метилци­тозина в 3-4 раза больше, чем цитозина. Ско­рость же дезаминирования аденина в гипоксантин и гуанина в ксантин (приводящих к транзициям A —- G) составляет всего 2% от скорости дезами­нирования цитозина [48]. 

Установлено также, что в митохондриях нахо­дятся и другие метилированные основания - на­пример, N7-метилгуанин, N3-метиладенин, O6-метилгуанин. Первые два генерируются в мтДНК со скоростью 10-5 на пару нуклеотидов и приводят к формированию апуриновых сайтов в мтДНК, "за­полнение" которых осуществляется в процессе репликации [66]. O6-метилгуанин приводит к транзициям G → A, однако содержание таких оснований в ДНК митохондрий неизвестно [58]. 

Апуриновые/апиримидиновые сайты (AP сай­ты) - важный источник мутагенеза мтДНК - по­являются в результате спонтанной утраты осно­ваний или же под воздействием окислительного стресса, неэнзиматических (гидролиз метилиро­ванных оснований) или энзиматических (под дей­ствием ДНК-гликозилаз) процессов, приводящих к повреждениям ДНК. Сообщалось, что скорость накопления AP сайтов в мтДНК крыс и свиней со­ставляет ~2 х 10-6  на пару нуклеотидов [35]. Наи­более интенсивно проходят процессы депуринизации ДНК - скорость депиримидинизации со­ставляет всего 5% от скорости депуринизации, а утрата пуриновых оснований происходит со ско­ростью от 1.7 х 10-6  до 3.3 х 10-7 на пару нуклеотидов [48]. AP сайты, как правило, блокируют синтез ДНК, однако некоторые полимеразы, в том числе и митохондриальная ДНК полимераза у, способны обходить повреждения ДНК и запол­нять "бреши" преимущественно адениновыми ос­нованиями [69]. В результате в зависимости от природы поврежденного сайта такой тип мутаге­неза приводит к появлению трансверсий G→T и A→T, а также транзиций G→A [49].



репликация мтднк животных и человека 

Исследования процесса репликации мтДНК у животных были начаты в середине 60-х годов прошлого века с использованием методов элек­тронной микроскопии и радиоавтографии в изо­лированных препаратах митохондрий из печени крыс и L-клеток мыши. К настоящему времени установлено, что митохондриальный геном жи­вотных реплицируется асинхронно [19]. В соот­ветствии с моделью асинхронной репликации мтДНК сначала инициируется репликация тяже­лой H-цепи посредством синтеза праймерной РНК в области промотора транскрипции легкой L-цепи (PL). В результате происходит формиро­вание 7S-фрагмента, комплементарного L-цепи главной некодирующей области мтДНК [38]. На электронных микрофотографиях замкнутых кольцевых форм мтДНК в этом участке образу­ется "петля смещения", или D-петля - трехнитчатая структура, в которой вновь синтезированный фрагмент длиной примерно 680 нуклеотидов при­соединен водородными связями к родительской L-цепи. Синтез мтДНК с помощью митохондриальной ДНК-полимеразы γ сопровождается рас­кручиванием двойной спирали, т.е. для инициации репликации мтДНК не требуются разрывы в од­ной из цепей ДНК. Инициация синтеза легкой це­пи начинается только после того, как реплициру­ется примерно 67% дочерней тяжелой цепи. Та­ким образом, в процессе репликации мтДНК H-цепь достаточно продолжительное время оста­ется в одноцепочечном виде.

Исследования показали, что механизмы репли­кации и транскрипции мтДНК достаточно консер­вативны у всех эукариотических организмов [76] и основными факторами в процессинге мтРНК яв­ляются РНКаза MRP и РНКаза P. Первый из этих факторов очень важен для формирования прай­мерной РНК, необходимой для инициации репли­кации H-цепи мтДНК. Синтез РНК в митохондри­ях осуществляется с помощью мтРНК-полимера-зы, гены которой у различных эукариотических организмов гомологичны таковым у бактериофа­гов E. coli.

В соответствии с моделью репликации мтДНК у позвоночных животных [77] ее инициация начи­нается с формирования праймерной РНК, синте­зируемой с промотора PL. Этот процесс активи­руется с помощью специального транскрипцион­ного фактора mtTFA. Несмотря на то, что анализ мтДНК различных видов позвоночных выявил видоспецифичные особенности организации главной некодирующей области, которая являет­ся основным регуляторным участком мтДНК, конфигурация расположения функциональных элементов в мтДНК позвоночных сходна, что предполагает консервативность транскрипционно-зависимого механизма инициации репликации мтДНК. 

Нестабильность митохондриального генома более всего изучена у дрожжей. Показано, что де­фекты многих генов, кодируемых ядерным гено­мом, приводят к нестабильным фенотипам [76]. Многие из этих ядерных генов участвуют в про­цессе транскрипционно-зависимой репликации мтДНК: например, гены ДНК-полимеразы γ,  ген MTF1, кодирующий фактор инициации транс­крипции, ген RIM1, кодирующий митохондриальный белок для связывания с одноцепочечной ДНК (mtSSB), и многие другие (не менее 30 генов) [76]. В случае митохондриальных геномов живот­ных мутации в ядерных генах, во-видимому, так­же влияют на функционирование митохондрий - наиболее ярко об этом свидетельствуют данные о митохондриальных болезнях человека [85]. Круг ядерных генов, вовлеченных в формирование па­тологических фенотипов митохондрий, постоянно расширяется. Из них наиболее известны гены, ко­дирующие каталитические субъединицы мтРНК-и мтДНК-полимераз, транскрипционного факто­ра mtTFA, mtSSB, ДНК-лигазы III. 

В отличие от ядерного генома, молекулы мтДНК разрушаются в митохондриях независимо от стадии клеточного цикла, в связи с чем в реп­ликации может участвовать лишь их часть, при­чем репликация мтДНК начинается в первую очередь в митохондриях перинуклеарного прост­ранства [21]. Первоначально предполагалось, что делетированные молекулы мтДНК могут накап­ливаться в клетках, поскольку меньшие по разме­ру молекулы мтДНК должны реплицироваться быстрее, чем мтДНК дикого типа [84]. Однако дальнейшие исследования показали, что реплика­ция мтДНК не лимитируется скоростью этого процесса (процесс репликации мтДНК заверша­ется в течение <90 минут), в связи с чем более бы­страя репликация делетированных молекул не должна оказывать существенного влияния на со­отношение делетированных молекул и молекул ДНК дикого типа в митохондриях [77]. Более то­го, гипотеза о замещении мтДНК делетированными молекулами за счет более высокой скоро­сти их репликации не может объяснить, каким об­разом происходит увеличение количества молекул мтДНК с точечными нуклетидными например, в тканях пациентов с митохондриальными болезня­ми. Другие гипотезы (их обзор см. в [25]) предпола­гают наличие селективных механизмов, с помо­щью которых мутантные молекулы мтДНК либо получают преимущество на стадии репликации, либо подвергаются элиминации с меньшей интен­сивностью, чем молекулы мтДНК дикого типа. Эти гипотезы сложно проверить эксперимен­тально: известно, что молекулы мтДНК характе­ризуются временем полураспада (Т₁/₂), равным 10 дням, однако, существуют ли различия между значениями T₁/₂ для мтДНК мутантного и дикого типов пока неизвестно. Наиболее вероятной к настоящему времени представляется модель случайного внутрикле­точного дрейфа, объясняющая клональную экс­пансию мутаций мтДНК. Компьютерное модели­рование процесса распространения патологичес­ких мутаций мтДНК в клетках выполнено в работе [25]. В качестве примера была выбрана делеция в гене цитохром-с-оксидазы (COX), при­сутствие которой более чем в 50-60% молекул мтДНК уже вызывает биохимические дефекты митохондрий, что проявляется в соответствую­щей клинической картине - COX-дефиците [34]. Показано, что модель "расслабленной" репликации мтДНК, в соответствии с которой в репликации участвует лишь часть молекул [77], в сочетании с дрейфом в популяции молекул мтДНК может объ­яснить быстрое распространение мутантной моле­кулы мтДНК без допущений о репликативном преимуществе в синтезе "укороченных" молекул мтДНК. Моделирование распространения мута­ции в одной из молекул мтДНК на протяжении 80 лет 
жизни индивидуума выявило также, что наиболее критическим периодом жизни является детство и юность - например, 46% мутантных мтДНК наблюдается в клетках 15-ти летних ин­дивидуумов. Мутации, возникшие в более позд­нем возрасте практически не имеют шанса до­стичь критического уровня (50-60%) своего со­держания в клетках к старости (т.е. к 80 годам жизни согласно модели) [25]. Этот вывод не согла­суется с гипотезой "порочного круга" [85], утверж­дающей, что все мутации мтДНК аккумулируются к старости (и в старости) вследствие возрастного ослабления эффективности дыхательных цепей митохондрий, приводящего к увеличению про­дукции свободных радикалов в митохондриях, повреждающих мтДНК и так далее. Между тем, результаты моделирования процессов распрост­ранения мутации в популяции мтДНК хорошо согласуются с экспериментальным данными, сви­детельствующими о том, что лишь менее 5% постмитотических клеток мозга и мышечной тка­ни у здоровых стареющих людей, достигших 80 лет, характеризуются признаками развития COX-дефицита [25]. 

РЕПАРАЦИЯ МТДНК ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА 

К числу причин, объясняющих быструю эволю­цию мтДНК, часто относят низкую эффективность систем репарации митохондриальных геномов [20]. Между тем репарация нуклеотидных замен типа трансверсий, по всей видимости, осуществляется достаточно эффективно с учетом того, что транс­версии в спектрах мутаций мтДНК человека на­блюдаются довольно редко - в среднем, на поря­док реже, чем транзиции [17, 51].

Длительное время считалось, что в митохонд­риях животных отсутствуют ферменты, необхо­димые для узнавания повреждений нуклеотидов и выполнения точной репарации ДНК [20]. Поэто­му предполагалось, что вследствие высокой копийности ДНК в митохондриях поврежденные молекулы просто элиминируются из популяции (клона) мтДНК [5, 41]. Однако к настоящему вре­мени установлено, что митохондрии высших ор­ганизмов содержат практически все компоненты, требуемые для репарации поврежденных основа­ний нуклеотидов [11, 41]. Одним из примеров ре­парации мтДНК являются результаты [22], авто­ры которого с помощью лигазной ПЦР показали полное удаление окисленных оснований мтДНК крысы за 8 часов. Обнаружено также, что комби­нация ферментов, выделенных из митохондрий X.

laevis, способна эффективно репарировать апури-новые/апиримидиновые сайты (AP сайты) мтДНК [68]. 

Процессы спонтанной утраты оснований нук-леотидов или их модификации вследствие реак­ций окисления и алкилирования относятся к чис­лу наиболее распространенных в митохондриях, что связано с основной функцией этих органелл клетки - работой электронно-транспортной сис­темы [22, 48]. Наличие в митохондриях млекопи­тающих ДНК-гликозилаз (например, урацил-ДНК гликозилазы и 8-оксогуанин-ДНК гликози-лазы) свидетельствует о том, что удаление по­врежденных оснований в мтДНК осуществляется энзиматическим путем. Показано также, что ре­парационная система митохондрий включает и необходимые для репарации поврежденных осно­ваний ДНК - AP-эндонуклеазу и AP-лиазу, обеспе­чивающие разрезание цепи ДНК и последующее удаление нуклеотидов с поврежденными основа­ниями [11]. Установлено, что лиазную активность проявляет каталитическая субъединица ДНК-по­лимеразы у, с помощью которой осуществляется синтез ДНК в митохондриях [68]. ДНК-лигаза также была обнаружена в митохондриях [11, 68]. Таким образом, исследования показали, что в ми­тохондриях может происходить репарация моди­фицированных нуклеотидных оснований, напри­мер, таких как 5-метилцитозин, продукт дезаминирования которого может быть репарирован с участием урацил-ДНК гликозилазы [48]. Инте­ресно, что в митохондриях, геном которых со­ставляет лишь 0.1% от клеточной ДНК, находит­ся избыточное количество этого фермента, со­ставляющее примерно 25% общей активности урацил-ДНК гликозилазы в клетке [11]. Извест­но, что в митохондриях возможно удаление и дру­гих метилированных оснований ДНК. Например, остатки O⁶-метил- или этилгуанина репарируются в митохондриях клеток печени крысы с помо­щью O⁶-метилгуанин метилтрансферазы, кото­рая вероятно в случае необходимости может транспортироваться из ядра в митохондрии [62].

Однако другие репарационные системы, име­ющиеся в клетке для репарации ядерной ДНК, в митохондриях, по-видимому, отсутствуют. В клет­ках млекопитающих до сих пор не обнаружены ферменты, участвующие в пострепликационной mismatch-репарации мтДНК (MMR-системы ре­парации). Лишь у дрожжей идентифицированы белковые гомологи бактериальных ферментов MutS и MSH1, которые могут быть транспорти­рованы в митохондрии [70]. Таким образом, прак­тически полное отсутствие в митохондриях фер­ментов системы mismatch-репарации позволяет считать, что мутационные спектры мтДНК в большой степени обусловлены репликационными ошибками ДНК-полимеразы у. Установлено, что в митохондриях не репари-руются пиримидиновые димеры и продукты взаи­модействия химических канцерогенов с мтДНК. Также не обнаружены пока компоненты систе­мы, необходимой для репарации коротких делеций и инсерций [11]. Возможно, по этой причине делеции и инсерции имеют определенную распро­страненность в мутационных спектрах мтДНК. Так, делеции мтДНК часто наблюдаются при на­следственных митохондриальных заболеваниях человека, а также сопровождают процессы ста­рения [84, 85].

Отсутствие гистонов или негистоновых белков, способных защитить молекулы мтДНК от пора­жающего воздействия продуктов окислительно-восстановительных реакций, активно протекаю­щих в митохондриях, также долгое время счита­лось одной из причин, объясняющих повышенную интенсивность накопления мутаций в мтДНК. Од­нако исследования последних лет убедительно до­казали, что подобную защитную функцию пер­вичной структуры мтДНК выполняет мульти-функциональный белок TFAM (или mtTFA). Он неспецифически взаимодействует с различными участками молекулы мтДНК, покрывая ее в ито­ге всю целиком, и проявляет повышенное сродст­во с промоторным регионом мтДНК, поврежден­ными нуклеотидами и участками палиндромно-шпилечных структур. Предполагается, что имен­но связывание белка TFAM с поврежденными ос­нованиями (например, с 8-OH-dG) инициирует ме­ханизм селективной деградации поврежденных молекул мтДНК [41].

особенности мутационного спектра мтднк человека 

Одной из особенностей мутационных спектров мтДНК животных и человека является преобла­дание транзиций над трансверсиями. Эта особен­ность характерна и для спектров мутаций бакте­риальной и ядерной ДНК [40], однако, лишь в слу­чае спектров мтДНК преобладание транзиций над трансверсиями выражено в значительной сте­пени - например, до 30 : 1 у человека. Другая осо­бенность мутационного спектра мтДНК - гомоплазия мутаций, приводящая к многократному появлению идентичных, но независимых по проис­хождению, мутаций в определенных нуклеотидных позициях. Эта особенность обусловлена высо­кой скоростью накопления мутаций в мтДНК, осо­бенно в ее некодирующей области [8].

Уже первые сравнительно-эволюционные ис­следования мтДНК животных [15] показали, что гомоплазия мутаций влияет на степень диверген­ции между сравниваемыми видами, а множествен­ные мутации, возникшие в процессе эволюции ви­дов независимо и в разное время в идентичных нуклеотидных позициях, являются важной осо­бенностью мутагенеза мтДНК и требуют всесто­роннего изучения [15]. Установлено также, что гомоплазия мутаций играет существенную роль в эволюционной динамике главной некодирующей области мтДНК [8], причем в этом случае эффект гомоплазии сказывается не только при сопостав­лении мтДНК различных групп организмов, но и в пределах одного вида [80]. Полногеномный ана­лиз изменчивости мтДНК человека показал, на­пример, существование небольшого избытка го-моплазии мутаций - отношение наблюдаемого к ожидаемому числу параллельных мутаций соста­вило 1.6 для n = 66 геномов [24]. Однако кодирую­щие участки митохондриального генома человека и главная некодирующая область принципиально различаются по частоте появления параллельных мутаций - в главной некодирующей области час­тота гомоплазии в 31 раз выше, чем в кодирую­щей мтДНК по данным [28] и в 11 раз выше [52]. Следует отметить, что высокая частота гомопла­зии в ГВС1 мтДНК человека предполагалась и ранее при исследовании рестрикционного поли­морфизма кодирующих участков мтДНК и из­менчивости нуклеотидных последовательностей ГВС1 [53, 55], а также в филогенетическом иссле­довании изменчивости нуклеотидных последова­тельностей ГВС1 мтДНК [26, 33, 59, 83].

С использованием методов филогенетическо­го анализа к настоящему времени установлено, что в мтДНК существуют "горячие" точки - нуклеотидные позиции, которые характеризуются повышенной скоростью прямых и обратных му­таций [2, 3, 9, 26, 33, 55, 57, 59, 83]. Гипервариа­бельность нуклеотидных позиций приводит к по­явлению идентичных (параллельных) мутаций в филогенетически неродственных типах мтДНК, что может повлиять на оценки степени сходства между последовательностями мтДНК. Материа­лом для исследований распределения вариабель­ных позиций вдоль ГВС1 мтДНК служат, как пра­вило, данные о нуклеотидных последовательнос­тях этого участка генома в различных популяциях человека, объединенные в единую суммарную выборку [26, 33, 59, 83]. Однако такой подход не может дать реальную картину распределения ги­первариабельных позиций в мтДНК, так как од­ной лишь информации об изменчивости нуклеотидных последовательностей ГВС1 недостаточно для выявления с помощью методов филогенети­ческого анализа групп типов мтДНК, родствен­ных по происхождению. Более точную оценку распределения "горячих" точек в ГВС1 мтДНК может дать сравнительный анализ изменчивости нуклеотидных последовательностей ГВС1, объе­диненных в монофилетические кластеры мтДНК (группы мтДНК) на основании данных о рестрик-ционном полиморфизме кодирующих участков мтДНК [3, 57].

АНАЛИЗ МУТАЦИОННЫХ СПЕКТРОВ ГЛАВНОЙ НЕКОДИРУЮЩЕЙ ОБЛАСТИ МТДНК ЧЕЛОВЕКА

Анализ изменчивости и поиск "горячих" точек в гипервариабельных сегментах 1 и 2 (ГВС1 и 2) мтДНК состоял из следующих этапов: (1) кластери­зация нуклеотидных последовательностей мтДНК в монофилетические кластеры (т.е. группы типов мтДНК, родственных по происхождению) на ос­новании данных рестрикционного анализа коди­рующих участков митохондриального генома; (2) поиск вариабельных позиций ГВС1 и 2 в преде­лах каждой из групп типов мтДНК; (3) оценка час­тоты встречаемости определенных вариабельных позиций ГВС1 в различных группах типов мтДНК.

Проанализированы два набора популяцион-ных данных. Изменчивость ГВС1 мтДНК изучена в выборке из 4072 нуклеотидных последователь­ностей (между позициями 16092 и16365 в соответ­ствии с нумерацией, предложенной в работе [7]), выявленных в популяциях Евразии и относящих­ся к 34 группам и подгруппам мтДНК согласно [71] - A, B, C, D, E, F, H, HV*, I, J, K, M*, M1, N1a, N1b, N1c, N*, pre-HV, R*, T, U*, U1-U8, V, W, X, Y, Z. Изменчивость ГВС2 (между позициями 72 и 297) исследована в выборке из 735 индивидуаль­ных последовательностей из популяций Европы и Южной Америки [6, 28, 36]. ГВС2-типы мтДНК относились к 22 группам и подгруппам мтДНК - H, pre-V, V, HV*, J, T, X, I, W, K, U*, U2, U4-U8, A, B, C, D, Z. Во всех случаях в анализе не учитыва­лись точечные инсерции и делеции, а также трансверсии в нестабильном (A)_n(Py)_m-тракте, расположенном между позициями 16184 и 16193. 

На рис. 1 и 2 показаны реконструированные мутационные спектры ГВС1 и ГВС2 мтДНК. Спектр ГВС1 представлен 1051 нуклеотидной за­меной в 276 сайтах, а спектр ГВС2 - всего 115 му­тациями в 231 сайте. 

Частоты мутаций в спектрах мтДНК оказались неравными (табл. 1), однако, оба спектра характеризуются выраженным сме­щением в сторону транзиций. Из транзиций в обо­их спектрах мтДНК наиболее распространены пиримидиновые замены. Следует отметить, что полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований [51, 59, 79]. Анализ мутационного спектра ГВС1, прове­денный с помощью программы CLUSTERM [32], позволил выявить четыре класса нуклеотидных сайтов. В первый класс входят очевидные "холод­ные" сайты, в которых наблюдается от 0 до 2 не­зависимых (параллельных) мутаций на сайт. Вто­рой класс включает сайты, в которых зарегистри­ровано от 0 до 10 мутаций на сайт, третий - от 5 до 17, а четвертый - от 16 до 32 параллельных му­таций на сайт. Во всех случаях различия между наблюдаемыми и ожидаемыми распределениями частот параллельных мутаций на сайт были недостоверными (P = 0.63 для четырех распределений Пуассона).


Под "горячими" точками понимаются лишь те сайты, которые с вероятностью более 95% отно­сятся к классам "горячих" точек, т.е. классам, в которых наблюдаются наиболее высокие часто­ты параллельных мутаций [32, 73]. Для класса 3 "горячими" точками являются позиции, характе­ризующиеся появлением более чем 10 параллель­ных мутаций на сайт (P > 0.95), а порогова значе­ние для определения "горячих" точек в ГВС1 мтДНК составляет 11 мутаций. 

В табл. 2 приве­дены нуклеотидные позиции ГВС1 - "горячие" точки. Аналогичный анализ мутационного спектра ГВС2 мтДНК позволил выявить три класса пози­ций. В этом случае различия между наблюдаемы­ми и ожидаемыми распределениями частот па­раллельных мутаций на сайт также были статис­тически недостоверными (P = 0.34 для трех распределений Пуассона). Первый класс включа­ет "холодные" сайты с числом мутаций от 0 до 2, второй - позиции с числом параллельных мута­ций от 0 до 8; третий класс содержит лишь одну позицию с 14 мутациями на сайт. Однако недоста­ток популяционных данных по изменчивости ГВС2 и ПДРФ мтДНК обусловил то, что второй класс оказался гетерогенным - наряду с позициями, в ко­торых наблюдаются параллельные мутации, со­держит и довольно консервативные сайты. Тем не менее, в ГВС2 имеется 12 нуклеотидных позиций с пороговым значением, равным 3 параллельным мутациям на сайт (рис. 2). Наиболее высокие часто­ты параллельных мутаций характерны для пози­ций 146, 150, 152, 185,189, 195, 199, 204, 227.Анализ филогенетически реконструирован­ных спектров ГВС1 и 2 мтДНК позволил класси­фицировать нуклеотидные позиции в зависимос­ти от скорости мутаций в них и выявить классы "горячих" точек, а также представить списки "го­рячих" точек мтДНК. Важно отметить, что уча­стки ГВС1 и ГВС2 различаются по интенсивности возникновения параллельных мутаций - в ГВС1 наблюдается большее число параллельных мута­ций, а ГВС2 в большей степени подвержен влия­нию гомоплазии по числу параллельных мутаций на сайт, и сконцентрированы они лишь в несколь­ких "горячих" точках [56].

МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ 

МУТАЦИЙ В ГВС1 И ГВС2 МТДНК 

Один из наиболее значимых механизмов воз­никновения мутаций является смещение (дисло­кация) цепей ДНК на участках мононуклеотидных последовательностей или участках, способ­ных к формированию вторичных структур типа шпилек и петель [45]. Этот механизм объясняет появление делеций и инсерций мтДНК. Однако известно, что смещение цепей ДНК может приво­дить и к нуклеотидным заменам. На рис. 3 пред­ставлена модель дислокационного мутагенеза, вследствие которого смещение нуклеотида в праймерной или матричной цепи может вызы­вать в процессе репликации ДНК введение следу­ющего нуклеотида. Дальнейшее выпрямление цепи приводит к появлению неспаренной пары нуклеотидов и мутации в том случае, если не про­изойдет репарация нуклеотида [45]. Известно, что модель дислокационного мута­генеза может объяснять появление "горячих" то­чек ДНК в in vitro системах как с β- полимеразой [45], так и с митохондриальной γ- полимеразой [50]. Так, в исследованиях ДНК-полимеразы  [45] показано, что модель смещения матричной цепи ДНК объясняет появление "горячей" точки T   G в последовательности 5'-GTTTT-3' ("горя­чая" точка подчеркнута). 

Анализ выявил, что появление многих мута­ций в ГВС1 и ГВС2 согласуется с моделью дисло­кационного мутагенеза. Однако высокодостовер­ная статистическая поддержка (P = 0.012 и 0.006 для ГВС1 и ГВС2, соответственно) обнаружена только для модели дислокации праймерной цепи мтДНК (табл. 3).

 Эта модель объясняет появле­ние 20% "горячих" точек в ГВС1, а также появле­ние всех наиболее "быстрых" позиций в ГВС2. Ре­зультаты показывают, что дислокация матрич­ной цепи не вносит серьезного вклада в мутагенез мтДНК (P = 0.323 и 0.168 соответственно для ГВС1 и 2), однако, нельзя исключить, что этот тип мутагенеза может быть определяющим для AT-обогащенных участков мтДНК. Начиная с классических работ Бензера [10], известно, что мутационные "горячие" точки во многих случаях возникают вследствие влияния соседних нуклеотидов. По этой причине нами проведен контекстный анализ "горячих" точек с использованием биномиального теста [4], позво­ляющего реконструировать консенсусные после­довательности, которые включают "горячие" точки и соответствующее нуклеотидное окруже­ние. После исключения "горячих" точек, возник­новение которых обусловлено дислокационным мутагенезом, нами анализировались раздельно "горячие" точки для четырех типов оснований A, G, С, T. Анализ ГВС1 позволил выявить два типа консенсусных последовательностей для нуклео­тидов С и T. Последовательность первого типа имеет вид KTNCNK (где K = G или T; "горячая" точка подчеркнута) и объединяет 25% "горячих" точек. В данном случае на возникновение мута­ций в нуклеотиде Т влияют нуклеотиды K в пози­ции -1 и нуклеотиды С и K в позициях +2 и +4, со­ответственно вероятность этих нуклеотидов P(NIJ,M,FI) варьирует в диапазоне между 0.002 и 0.0007, что меньше вероятности случайного появ­ления этих сайтов (P* = 0.008). 

В другом случае обнаруживается влияние на нуклеотид С цитозина в положении +1. Такой консенсусный сайт имеет вид СС (вероятность P(N_IJ,M,F_I) для С в положении +1 равна 0.005). Консенсусный сайт СС объясняет происхождение 42% "горячих" точек. Таким образом, контекстзависимые механизмы возникновения мутаций объясняют в целом происхождение 87% "горя­чих" точек в ГВС1 (рис. 4). 

Важно отметить, что в большинстве случаев "горячими" точками явля­ются пиримидиновые основания и поэтому суще­ствующий в мутационных спектрах мтДНК избы­ток пиримидиновых транзиций также может объ­ясняться контекст-зависимыми механизмами генерирования мутаций. 

Оба консенсусных сайта - короткие и поэтому часть повторяющиеся последовательности в ГВС1 мтДНК. Некоторые сайты СС и KTNCNK консервативны и поэтому вполне вероятно, что на частоту мутаций в них влияют еще какие-то дополнительные факторы. Так, регрессионый анализ показал, что проявления контекста в ГВС1 мтДНК достаточно сложные и не могут быть описаны только консенсусными сайтами СС and KTNCNK. Более того, не обнаружена досто­верная корреляция между этими сайтами и рас­пределением мутаций в ГВС2. Для проанализиро­ванного участка ГВС2 (табл. 3) 

пока не удалось выявить контекст-зависимых влияний на появле­ние мутаций.
Следует отметить, что распространенный в ГВС1 мтДНК гипервариабельный нуклеотидный мотив GTACAT [2] является частным случаем консенсуса KTNCNK. Два других гипервариа­бельных мотива АССС и ССТС [2] структурно связаны с консенсусом СС. Анализ показывает, что последовательность GTACAT может быть как гипервариабельной, так и консервативной. Так, в участках 16096-16101, 16156-16161 и 16329-16333 последовательность GTACAT прак­тически мономорфна, в то время как участок 16303-16315 включает две высоковариабельные последовательности GTACAT, которые в обоих случаях имеют "горячую" точку в первом из двух остатков тимина. Интересно, что последователь­ность GTACAT распространена в виде прямых по­второв не только в ГВС1 мтДНК человека, но и в главной некодирующей области мтДНК других млекопитающих [46]. Пониженная изменчивость участка 16154-16164, входящего в область терми-нации синтеза 7S ДНК (TAS), может объясняться важным значением TAS для функционирования митохондриального генома. Однако для других участков GTACAT данных об их влиянии на функционирование генома пока нет. Тем не ме­нее, все они могут принимать участие в формиро­вании вторичных структур, поскольку организова­ны в виде прямых повторов, частично инвертиро-ванны по отношению друг к другу и способны, таким образом, к формированию альтернативных палиндромно-шпилечных структур. Известно, на­пример, что у грызунов ETAS-участки, включаю­щие последовательности GTACAT и их производ­ные, формируют очень стабильные вторичные структуры со стеблем из 11-17 нуклеотидов и петлей из 5-9 нуклеотидов [46]. Более того, повто­ряемость GTACAT-мономеров приводит к появле­нию разнообразных альтернативных вторичных структур, различающихся как по числу шпилек, так и по числу мономеров в стеблях палиндромно-шпилечных структур. Очень вероятно, что по­добная организация характерна и  для главной не-кодирующей области мтДНК человека.

Между тем, более половины позиций в ГВС1 мтДНК относительно консервативны. Это обус­ловлено, по-видимому, в основном тем, что в главной некодирующей области (и в ГВС1, в част­ности) находятся функциональные элементы, не­обходимые для инициации и регуляции процессов репликации и транскрипции мтДНК. Понижен­ная изменчивость наблюдается, например, в кон­трольном элементе СЕ (между позициями 16194 и 16208), AP1-подобном элементе (между позиция­ми 16064 и 16070), SP- (16104 и 16106) и других ко­ротких участках ГВС1, возможно имеющих функ­циональное значение. Такая важная структура мтДНК как TAS, или область терминации синтеза 7S ДНК, расположенная между позициями 16157 и 16172, характеризуется неравномерным распре­делением полиморфных позиций - строго консер­вативной является лишь 5'-концевая область TAS между позициями 16157 и 16161.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

По мере накопления данных об изменчивости мтДНК в популяциях человека подход, предло­женный в настоящей работе, включающий ана­лиз изменчивости нуклеотидных последователь­ностей ГВС1 и 2, относящихся к определенным группам родственных по происхождению типов мтДНК, позволит оценить интенсивность мута­ционных процессов и особенности распределения гипервариабельных позиций в различных груп­пах мтДНК человека. Использование данного подхода в совокупности с методами анализа структурно-функциональной организации неко-дирующих областей мтДНК обеспечит получе­ние более полной информации о причинах гете­рогенности скорости мутаций в различных пози­циях мтДНК. Все это необходимо для более полного понимания особенностей механизмов му­тагенеза мтДНК и выяснения роли полинуклеотидного контекста в возникновении мутаций.

Результаты данной работы позволили впер­вые объяснить причины существования "горя­чих" точек в главной некодирующей области мтДНК. Получены доказательства того, что воз­никновение мутаций в ГВС1 мтДНК почти в 90% "горячих" точек обусловлено контекст-зависи­мыми механизмами мутагенеза.

Одним из механизмов генерирования мутаций является дислокационный мутагенез, наблюдае­мый в исследованиях in vitro [45 , 50]. Показано также, что появление точечных мутаций в ядер­ных генах человека может быть обусловлено сходными механизмами [44]. Проведенное иссле­дование продемонстрировало, что модель дисло­кационного мутагенеза имеет высокую статисти­ческую поддержку для объяснения появления "горячих" точек в гипервариабельных сегментах мтДНК (в спектры мтДНК, реконструированные с использованием филогенетического подхода на основе популяционных данных об изменчивости мтДНК, т.е. in vivo). Тем не менее, появление зна­чительной доли "горячих" точек мтДНК объяс­няется влиянием контекста ДНК вблизи гиперва­риабельных оснований.

Известно, что причиной дислокационного му­тагенеза являются ошибки ДНК полимеразы, возникающие при репликации ДНК [50]. Таким образом, дислокационный мутагенез в ГВС1 и ГВС2 мтДНК может быть следствием ошибок, генерированных митохондриальной ДНК-поли-меразой у в процессе репликации мтДНК. Выяв­ленные нами различия между моделями, учиты­вающими смещение праймерной и матричной це­пей, могут быть обусловлены различиями в репликации цепей мтДНК и/или мутационной специфичностью полимеразы у (например, неко­торые дислокационные ошибки могут быть супрессированы ДНК-полимеразой с помощью ре­дактирования, зависящего от контекста ДНК [50]). Модель, основанная на предположении о смещении праймерной цепи в процессе реплика­ции, предсказывает повышенный мутагенез для политрактов [45, 50], и это условие полностью со­блюдается для ГВС1 и ГВС2, характеризующихся высоким содержанием монотонных повторяю­щихся последовательностей. Например, поли-С тракты мтДНК часто подвержены дислокацион­ному мутагенезу (табл. 3). Это свидетельствует о том, что смещение праймерной цепи в процессе репликации является важнейшим контекст-зави­симым механизмом мутагенеза мтДНК человека. Установлено, что соматический мутагенез в "горячих точках" генов ядерной ДНК (например, генов иммуноглобулинов), обусловлен в значитель­ной мере ошибками синтеза, осуществляемого с по­мощью ДНК-полимеразы ц [74]. Аналогично выяв­лено, что, несмотря на достаточно высокую точ­ность синтеза ДНК с помощью митохондриальной ДНК-полимеразы у, точность ее существенно по­нижается на гомополимерных трактах длиной бо­лее 4 нуклеотидов [50]. Показано также, что то­чечные замены и делеции в гомополимерных уча­стках ДНК могут быть результатом ошибок полимеразы у вследствие спонтанного проскаль­зывания цепей ДНК в процессе репликации. Полу­ченные данные свидетельствуют, что гомополи-мерные тракты мтДНК могут быть подвержены in vivo мутациям типа "сдвига рамки" вследствие ошибок синтеза ДНК-полимеразой у [50]. Учиты­вая существенное превышение числа транзиций над трансверсиями в спектрах мутаций мтДНК, следует признать, что окислительные поврежде­ния оснований (например, формирование 8-OH-dG), приводящие, в основном, к трансверсиям, не являются основной причиной возникновения митохондриальных мутаций. Напротив, спонтанная потеря оснований, их дезаминирование и некото­рые окислительные повреждения нуклеотидов, приводящие к появлению AP сайтов, могут высо­кую частоту в мутационных спектрах мтДНК транзиций (в частности, мутаций типа G —»- А). Аналогичный тип мутаций может наблюдаться и в случае спонтанного дезаминирования цитозина. Другой распространенный в мутационных спект­рах мтДНК тип мутаций - транзиция А —»- G, мо­жет генерироваться в процессе репликативного дезаминирования аденина в гипоксантин. Таким образом, в настоящее время уже намечены гипо­тетические пути для разгадки причин высокого уровня мутагенеза мтДНК [50, 58], однако, требу­ются дальнейшие исследования в этом несомненно приоритетном направлении современной молеку­лярной генетики.

Весьма перспективными представляются ис­следования молекулярных основ самих механиз­мов генерирования мутаций. И если происхожде­ние дислокационного мутагенеза может быть обусловлено дефектами генов митохондриальной ДНК-полимеразы, то другие контекст-зависимые механизмы пока не находят своего объяснения. Изучение механизмов мутагенеза мтДНК имеет важное значение не только в плане общего пони­мания особенностей мутационных процессов, но и для исследования наследственных митохондри-альных болезней человека. Так, известно, что многие митохондриальные заболевания ассоцииру­ются с определенными вариантами полиморфизма мтДНК. Более того, патологические мутации, как правило, появляются независимо в различных ми-тохондриальных линиях, но в определенных нук­леотидных позициях мтДНК, т.е. в "горячих" точ­ках. Одна из возможных причин возникновения подобных патологических мутаций - генетичес­кие дефекты ДНК-полимеразы или ядерных бел­ковых факторов, участвующих в контроле репли­кации мтДНК. Так, ранее была установлена связь между мутациями в генах полимеразы у (POLG) и множественными делециями мтДНК, которыми сопровождаются аутосомно-доминантная и ауто-сомно-рецессивная формы прогрессирующей на­ружной офтальмоплегии (PEO) [82]. Предполага­ется, что мутации в генах POLG приводят к измене­нию активности этого фермента, а наблюдаемая в ГВС1 мтДНК гетерогенность (в форме гетероплазмии на индивидуальном уровне) по длине поли-С участка, расположенного между позициями 16184 и 16193, обусловлена влиянием ядерных факторов, входящих в систему репликации мтДНК [54]. У больных PEO обнаружены также мутации в ге­не, кодирующем белок Twinkle, который прояв­ляет высокое структурное сходство с прайма-зой/геликазой, кодируемой геном 4 фага T7 [78]. У этого фага праймаза/геликаза, наряду с ДНК- и РНК-полимеразой, белком SSB и ДНК-лигазой, входит в состав репликационной "машины", обес­печивающей репликацию ДНК. Таким образом, и Twinkle может участвовать в репликации мтДНК человека в качестве праймазы/геликазы, т.е. лю­бые генетические изменения этого белка могут привести к изменениям в процессе репликации мтДНК и даже к прекращению синтеза мтДНК полимеразой у [61, 78]. Полученные данные о преимущественном влиянии контекста ДНК на возникновение мутаций в процессе эволюции мтДНК подтверждаются и результатами исследо­ваний спектров соматических мутаций в тканях и культивированных клетках больных митохондри-альной нейрогастроинтестинальной энцефаломи-опатией [64]. Так, было показано, что изменения нуклеозидного метаболизма у пациентов с дефи­цитом тимидин фосфорилазы приводят к множе­ственным контекст-специфическим мутациям, наиболее вероятными причинами возникновения которых являются дислокационный мутагенез и влияние ближайшего нуклеотидного окружения. Результаты этого исследования позволили за­ключить, что продукты окислительно-восстано­вительных реакций в митохондриях (приводящих, например, к появлению 8-OH-dG) не оказывают существенного влияния на генерирование точеч­ных мутаций мтДНК [64].

Таким образом, полученные данные свидетель­ствуют о разнообразии молекулярных механиз­мов приводящих к появления мутаций, однако, практически все они (особенно для "горячих" то­чек мтДНК) сводятся к влиянию контекста ДНК и обусловлены ошибками, возникающими при репликации мтДНК. Пока неизвестно, является ли повышенная изменчивость мтДНК следствием отсутствия эффективных систем репарации и от­носятся ли митохондриальные мутации в "горя­чих" точках к числу не или труднорепарируемых. Для этого, очевидно, необходимы эксперименты по репликации мтДНК в митохондриях в присут­ствии систем репарации ДНК, включающих ком­поненты, которые (как считается в настоящее время [11]) отсутствуют в органеллах. Тем не ме­нее, выявление "горячих" точек мтДНК и объяс­нение причин их происхождения с помощью соот­ветствующих моделей представляется важным итогом исследований изменчивости и эволюции мтДНК человека.

Автор искренне благодарен И.Б. Рогозину

(ИЦиГ СО РАН) и М.В. Деренко (ИБПС ДВО

РАН) за помощь в проведении данного исследо­вания. Работа выполнена при финансовой под­держке Дальневосточного отделения Российской академии наук (грант 03-3-А-06-096).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Малярчук Б.А. // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29.Вып. 2. С. 281. 

2. Малярчук Б.А. // Молекуляр. биология. 2002. Т. 36. < 3. С. 418. 

3. Малярчук Б.А, Деренко М.В. // Генетика. 2001. Т. 37. < 7. С. 991. 

4. Поздняков М.А., Рогозин И.Б, Бабенко ВН., Колчанов Н.А. // Докл. РАН. 1997. Т. 356. < 4. С. 566. 

5. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органел-лы. М.: Мир, 1975. 423 с. 

6. Alves-Silva J., da Silva Santos M, Guimaraes P.E.M., Ferreira A.C.S., Bandelt H.-J., Pena S.D.J, Prado V.F. // Am. J. Hum. Genet. 2000. V. 67. < 2. P. 444. 

7. Anderson S., Bankier A.T., BarrelB.G, de Bruijn M.H.L., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J.M., Sta-den R., Young I.G. // Nature. 1981. V. 290. < 5806. P. 457. 

8. Aquadro C.F, Greenberg B.D. // Genetics. 1983. V. 103. < 2. P. 287. 

9. Bandelt H.-J., Quintana-Murci L, Salas A., Macaul-ay V. // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 71. < 5. P. 1150. 

10. Benzer S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. V. 47. < 2. P. 403. 

11. Bogenhagen D.F. // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. < 5. P. 1276. 

12. Boveris A., Oshino N., Chance B. // J. Biochem. 1972. V. 128. < 3. P. 617. 

13. Brierley E.J, Johnson M.A., Lightowlers R.N., James O F, Turnbull DM. // Ann. Neurol. 1998. V. 43. < 2. P. 217. 

14. Brown W.M., George M.Jr, Wilson A.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. < 4. P. 1967. 

15. Brown W.M., Prager EM, Wang A, Wilson A.C. // J. Mol. Evol. 1982. V. 18. < 4. P. 225. 

16. Brown G.G., Simpson M.V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. < 10. P. 3246. 

17. Cantatore P., Saccone C. // Internatl. Rev. Cytol. 1987. V. 108. P. 149. 

18. Cheng K.C., Cahill D.S., Kasai H., Nishimura S., Loeb LA. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. < 1. P. 166. 

19. Clayton D.A. // Cell. 1982. V. 28. < 4. P. 693. 

20. Clayton D.A, Doda J.N., Friedberg E.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. < 2. P. 2777. 

21. Davis A.F., Clayton D.A. // J. Cell Biol. 1996. V. 135. 

< 4. P. 883. 

22. Driggers W.J., Holmqiust G.P., LeDoux S.P., Wil­son G.L. // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. < 21. P. 4362. 

23. Ehrlich M, Zhang X.Y., Inamdar N.M. // Mutat. Res. 1990. V. 238. < 3. P. 277. 

24. Elson J.L, Andrews R.M., Chinnery P.F., Lightowl­ers R.N., Turnbull DM, Howell N. // Am. J. Hum. Gen­et. 2001. V. 68. < 1. P. 145. 

25. Elson J.L., Samuels D.C., Turnbull D.M., Chin-nery P.F. // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. < 3.P. 802.


26. Excoffier L, Yang Z. // Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. № 10. P. 1357.

27. Feig DI, Sowers L.C, Loeb LA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 14. P. 6609.

28. Finnila S., Lehtonen M.S., Majamaa K. // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. № 6. P. 1475.

29. Fuku N., Oshida Y., Takeyasu T., Guo L.J, Kurata M., Yamada Y, Sato Y, Tanaka M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290. № 4. P. 1199.

30. Giannelli F. // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. № 6. 

P. 1535. 

31. Giles R.E., Blanc H, Cann H.M., Wallace D.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. № 11. P. 6715. 

32. Glazko G.V., Milanesi L, Rogozin I.B. // J. Theor. Biol. 1998. V. 192. № 4. P. 475. 

33. Hasegawa M., Di Rienzo A., Kocher T, Wilson A. // J. Mol. Evol. 1993. V. 37. № 4. P. 347. 

34. Hayashi J., Ohta S., Kikuchi A., Takemitsu M., Goto Y., Nonaka I. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 23. P. 10614. 

35. Hegler J., Bittner D, Boiteux S, Epe B. // Carcinogenet-ics. 1993. V. 14. № 11. P. 2309. 

36. Helgason A., Sigurdardottir S., Gulcher J.R., Ward R., 

Stefansson K. // Am. J. Hum. Genet. 2000. V. 66. № 3. P. 999. 

37. Hruszkewycz A.M., Bergtold D.S. // Mutat. Res. 1990. 

V. 244. № 2. P. 123. 

38. HudsonB, Upholt W.B., Devinny J., Vinograd J. // Proc. Natl. Acad. Sci. US. 1969. V. 62. № 3. P. 813. 

39. Ingman M., Kaessmann H., Paabo S., Gyllensten U. // Nature. 2000. V. 408. № 6813. P. 708. 

40. Jukes T.H, Bhushan V. // J. Mol. Evol. 1986. V. 24. № 1. 

P. 39. 

41. Kang D, Hamasaki N. // Curr. Genet. 2002. V. 41. № 6. 

P. 311. 

42. Kimura M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. 

№ 10. P. 5773. 

43. Krakauer D.C, Mira A. // Nature. 1999. V. 400. 

№ 6740. P. 125. 

44. Krawczak M, Ball E.V., Cooper D.N. // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 63. № 2. P. 474. 

45. Kunkel T.A. // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. № 9. P. 5787. 

46. Larizza A., Pesole G, Reyes A, Sbisa E., Saccone C. // 

J. Mol. Evol. 2002. V. 54. № 2. P. 145. 

47. Le Page F., Guy A., Cadet J., Sarasin A., Gentil A. // Nu­cleic Acids Res. 1998. V. 26. № 5. P. 1276. 

48. Lindahl T. // Nature. 1993. V. 362. № 6448. P. 709. 

49. Loeb L.A., Preston B.D. // Annu. Rev. Genet. 1986. 

V. 20. P. 201. 

50. Longley M.J, NguyenD, Kunkel T.A., Copeland W.C. // J. Biol. Chem. 2001.V. 276. № 42. P. 38555. 

51. Lutz S., Weisser H.-J., Heizmann J., Pollak S. // Int. J. Legal Med. 1998. V. 111. № 2. P. 67. 

52. Maca-Meyer N., Gonzalez A.M., Larruga J.M., Flores C, Cabrera V.M. // BMC Genetics 2001. V. 2. № 1. P. 13. 

53. Macaulay V., Richards M., Hickey E, Vega E., Cru-ciani F., Guida V., Scozzari R., Bonne-Tamir B, Sykes B, Torroni A. // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 64. 

№ 2. P. 232.

54. Malik S., Sudoyo H., Pramoonjago P., Suryadi H., Sukarna T., Njunting M., Sahiratmadja E., Marzuki S. // Hum. Genet. 2002. V. 110. № 5. P. 402.


55. Malyarchuk B.A., Derenko M.V. // Ann. Hum. Genet.


1999. V. 63. Pt. 6. P. 489.


56. Malyarchuk B.A., Grzybowski T., Derenko M.V., Czarny J., Wozniak M., Miscicka-Sliwka D. // Ann.


Hum. Genet. 2002. V. 66. Pt. 4. P. 261.


57. Malyarchuk B.A., Rogozin I.B., Berikov V.B., Deren-ko M.V. // Hum. Genet. 2002. V. 111. № 1. P. 46.


58. Marcelino LA, Thilly W.G. // Mutat. Res. 1999. V. 434. № 3. P. 177.


59. Meyer S., Weiss G, von Haeseler A. // Genetics. 1999. V. 152. № 3. P. 1103.


60. Mita S., Monnat Jr. R.J., Loeb L.A. // Cancer Res. 1988.


V. 48. № 16. P. 4578.


61. Moraes C.T. // Nat. Genet. 2001. V. 28. № 6. P. 200.


62. Myers K.A., Saffhill R., O'Connor P.J. // Carcinogene­sis. 1988. V. 9. № 2. P. 285.


63. Nass M.M. // J. Mol. Biol. 1973. V. 80. № 1. P. 155.


64. Nishigaki Y., Marti R., Copeland W., Hirano M. // J. Clin. Invest. 2003. V. 111. № 12. P. 1913.


65. Parcucci B., Versteegh A., van Hoffen A., van Zeeland A.A., Mullenders L.H, Dogliotti E. // J. Mol. Bi­ol. 1997. V. 273. № 2. P. 417.


66. Park J.W., Ames B.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 20. P. 7467.


67. Perez G.I., Trbovich A.M., Gosden R.G., Tilly J.L. // Na­ture. 2000. V. 403. № 6769. P. 500.


68. Pinz K G, Bogenhagen D.F. // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. № 3. P. 1257.


69. Pinz K.G., Shibutani S., Bogenhagen D.F. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 16. P. 9202.


70. Reenan R.A., Kolodner R.D. // Genetics. 1992. V. 132.


№ 4. P. 963.


71. Richards M., Macaulay V., Hickey E., Vega E., Sykes B., Guida V., Rengo C, Sellito D., Cruciani F., Kivisild T., Villems R., Thomas M., Rychkov S., Rychkov O, Rychk-ov Yu., Golge M, Dimitrov D, Hill E, Bradley D., Ro­mano V., Cali F., Vona G., Demaine A., Papiha S., Tri-antaphyllidis C., Stefanescu G., Hatina J., Belledi M., Di Rienzo A., Novelletto A., Oppenheim A., Norby S., Al-Za-heri N., Santachiara-Benerecetti S., Scozzari R., Torro­ni A., Bandelt H.-J. // Am. J. Hum. Genet. 2000. V. 67. № 11. P. 1251.


72. Richter C, Park J.-W, Ames B.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 17. P. 6465.


73. Rogozin IB, Kondrashov F.A., Glazko G.V. // Hum. Mut. 2001. V. 17. № 2. P. 83.


74. Rogozin I.B., Pavlov Y.I., Bebenek K., Matsuda T., Kunkel T. // Nat. Immunol. 2001. V. 2. № 6. P. 530.


75. Satoh M.S., Huh N., Rajewsky M.F., Kuroki T. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. № 14. P. 6854.


76. Shadel G.S. // Am. J. Hum. Genet. 1999. V. 65. № 5.


P. 1230.


77. Shadel G.S., Clayton D.A. // Ann. Rev. Biochem. 1997.


V. 66. P. 409.


78. Spelbrink J.N., Li F.-Y, Tiranti V, Nikali K, Yuan Q.-P, Tariq M., Wanrooij S., Garrido N., Comi G, Morandi L., Santoro L., Toscano A., Fabrizi G.-M., Somer H,


Croxen R., Beeson D., Poulton J., Suomalainen A., Ja­cobs H.T., Zeviani M, Larsson C. // Nat. Genet. 2001.

V. 28. № 6. P. 223.

79. Tamura K. // Gene. 2000. V. 259. № 1. P. 189.

80. Tamura K, Nei M. // Mol. Biol. Evol. 1993. V. 10. № 3. P. 512.

81. Topal M.D., Fresco J.R. // Nature. 1976. V. 263.

№ 5575. P. 285.



82. Van Goethem G., Dermaut B., Lofgren A., Martin J.J.,

Van Broeckhoven C. // Nat. Genet. 2001. V. 28. № 6. P. 211.

83. Wakeley J. // J. Mol. Evol. 1993. V. 37. № 6. P. 613.

84. Wallace D.C. // Am. J. Hum. Genet. 1995. V. 57. N.2.

P. 201.

85. Wallace D.C. // Science. 1999. V. 283. № 5407. P. 1482.