СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИОННЫХ СПЕКТРОВ ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНОГО СЕГМЕНТА I В ФИЛОГЕОГРАФИЧЕСКИХ ГРУППАХ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА

Б. А. Малярчук

Институт биологических проблем Севера Дальневосточного отделения Российской академии наук, Магадан, 685000.

   Проанализирована изменчивость нуклеотидных последовательностей гипервариабельного сегмен­та 1 мтДНК, относящихся к 88 филогеографическим кластерам, распространенным среди населе­ния Африки, Западной и Восточной Евразии. Выявлены достоверные различия в распределении мутаций в митохондриальных генофондах региональных групп человека. Приведен список нуклео­тидных позиций гипервариабельного сегмента 1, нестабильность которых объясняется моделью дислокации (смещения) цепей мтДНК в процессе репликации. Показано, что смещение цепей ДНК является одним из главных механизмов контекст-зависимого мутагенеза мтДНК в процессе регио­нальной дифференциации популяций человека.
Ключевые слова: митохондриальная ДНК человека, главная некодирующая область, гипервариа­бельный сегмент 1, нуклеотидные замены, "горячие" точки, механизмы мутагенеза. 

Геном митохондрий человека представлен коль­цевыми молекулами ДНК размером 16569 п.н., ко­торые наследуются клонально по материнской линии без рекомбинации [1, 2]. Изучение измен­чивости митохондриального генома приобрело особую актуальность в последние десятилетия в связи с развитием исследований в области эволю­ции человека, генетической истории этнорасовых групп и молекулярной медицины.

С помощью популяционно-генетических ис­следований установлено, что митохондриальный генофонд человека характеризуется континент-специфическим распределением монофилетичес-ких кластеров (групп и подгрупп) ДНК, а гено­фонды этнорасовых групп человека представле­ны различными комбинациями групп мтДНК [2]. Согласно данным филогеографических исследо­ваний, все евразийские группы мтДНК входят в состав трех макрогрупп - M, N и R, которые произошли из единственной африканской группы L3 и начали распространяться в Евразии ~60 тыс. лет тому назад по мере освоения ее территорий чело­веком современного типа [3-5]. Митохондриальные генофонды популяций западной и восточной частей Евразии имеют различное происхождение и принципиально различаются по составу групп мтДНК. В генофондах популяций Западной Евра­зии наибольшее распространение получили груп­пы мтДНК, относящиеся к макрогруппам N и R, в генофондах популяций Восточной Евразии -группы мтДНК, принадлежащие макрогруппе M, а также восточноевразийские разновидности ма­крогрупп N и R. Генофонды африканских популя­ций представлены группами мтДНК из макро­группы L.

Существование географических различий в распределении групп мтДНК у населения Евразии и Африки может объясняться с разных позиций. С одной стороны, эти различия могли возникнуть в результате случайных процессов. В этом случае следует предположить, что заселение человеком разных регионов Евразии изначально происходи­ло малыми по численности группами, вследствие чего дрейф генов играл исключительную роль в фиксации вариантов мтДНК, относящихся к оп­ределенным макрогруппам. С другой стороны, генетические различия между региональными группами населения Евразии могли возникнуть под воздействием отбора, которым сопровождал­ся процесс адаптации популяций к новым клима-то-географическим условиям. К настоящему вре­мени уже получены данные о возможном влиянии отбора на формирование особенностей митохондриальных генофондов различных региональных групп населения [6-11]. Так, при изучении измен­чивости нуклеотидных последовательностей пол­ногеномных мтДНК у населения тропической, умеренной и арктической зон [10] обнаружены различия в вариабельности митохондриальных генов, что может объясняться участием климати­ческих факторов в том комплексе причин, кото­рые привели к структурным различиям митохондриальных генофондов региональных групп насе­ления мира. Между тем, неизученным остается вопрос о том, в какой мере отбор мог повлиять на изменчивость главной некодирующей области мтДНК, в которой сосредоточены все структур­но-функциональные элементы, ответственные за инициацию и регуляцию процессов транскрипции и репликации митохондриального генома. Поэто­му, учитывая существующую филогеографическую структуру митохондриального генофонда, на первом этапе представляется целесообразным проанализировать мутационные спектры участ­ков главной некодирующей области мтДНК в разных региональных группах населения. Наибо­лее изучена изменчивость нуклеотидных после­довательностей гипервариабельного сегмента 1 (ГВС1) главной некодирующей области, который расположен в ее 5'-части. 

Цель настоящей работы состояла в анализе распределения нуклеотидных замен ГВС1 в типах мтДНК, относящихся к филогеографическим груп­пам, характерным для населения трех регионов ми­ра - Африки, Западной и Восточной Евразии.



УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА 

Поиск вариабельных позиций мтДНК прово­дили с помощью филогенетического подхода, позволяющего выявлять нестабильные нуклео-тидные позиции, в которых идентичные мутации возникали независимо и многократно в разных кластерах мтДНК [12]. Использовали данные об изменчивости нуклеотидных последовательнос­тей ГВС1 в монофилетических группах мтДНК, выделенных на основании данных о полиморфиз­ме кодирующих участков митохондриального ге­нома, темпы изменчивости которых значительно ниже. Анализируемая нами база данных пред­ставлена 7482 последовательностями ГВС1 мтДНК (между позициями 16092-16365), принад­лежащими к 88 группам мтДНК. Из них 28 групп (H, HV*, pre-V, pre-HV, R*, T1, T*, J*, J1a, J1b, J2, K, U*, U1, U2, U3, U4, U5, U7, U8a, U8b, N1a, N1b, N1c, N*, I, W, X) распространены у населения За­падной Евразии (n = 3834 последовательностей ГВС1 [13]), 34 группы мтДНК (C, Z, M8a, D4 (включая D*), D5, G2, G3, G4, E, M*, M7*, M7b, M7c, M9, M10, A, N9a, N2, N*, Y, R9a, R*, F*, F1a, F1b, F1c, F2, B*, B4*, B4a, B4b, B5*, B5a, B5b) рас­пространены в популяциях Восточной Евразии (n = 801 по данным [14-18]) и 26 групп мтДНК (L1a1, L1a2, L1b, L1c*, L1c1, L1c2, L1c3, L1d, L1e, L2a*, L2a1a, L2a1b, L2b, L2c, L2d1, L2d2, L3b1, L3b2 (включая L3b*), L3d, L3e1, L3e2, L3e3, L3e4, L3f*, L3f1, L3g) распространены в популяциях Африки (n = 2847 по данным [5]).

Анализ изменчивости и поиск вариабельных участков в ГВС1 мтДНК состоял из следующих этапов: (1) кластеризация нуклеотидных последо­вательностей ГВС1 в группы типов мтДНК, родст­венных по происхождению, на основании данных о распределении группоспецифических полиморф­ных вариантов кодирующих участков митохонд-риального генома с использованием метода меди­анных сетей; (2) поиск вариабельных позиций ГВС1 в пределах каждой из групп типов мтДНК; (3) оценка частоты встречаемости вариабельных позиций ГВС1 в разных группах типов мтДНК. Мутации учитывали относительно L-цепи кемб­риджской последовательности мтДНК человека [1], используемой в митохондриальной генетике в качестве эталонной. В анализе рассматривали только прямые мутации (единственное исключе­ние - позиция 16223), поскольку для идентифика­ции обратных мутаций и оценки независимости их появления в разных линиях мтДНК необходи­мо проведение анализа на уровне подгрупп мтДНК, что возможно пока лишь для некоторых групп мтДНК с хорошо охарактеризованной суб­структурой [5]. В позиции 16223 регистрировали и прямые, и обратные мутации, поскольку уста­новлено [3], что нуклеотидная последователь­ность ГВС1 кембриджской мтДНК, входящая в состав кластера R, отличается от эволюционно более ранних последовательностей мтДНК (N-, M- и L3-корневых) вариантом 16223C. Поэтому транзиции T —► C, приводящие к появлению кла­стера R и отдельных типов мтДНК в составе мак­рогрупп M и L, учитывали как прямые мутации, а транзиции C —► T, регистрируемые в различных группах мтДНК кластера R (H, J*, K, pre-HV, R*, U2, U3, U4, U5, B4), как обратные мутации. Частоту гомоплазии прямых мутаций рассчи­тывали по соотношению числа независимых появ­лений идентичных мутаций в различных филоге­нетических кластерах к общему числу проанализированных кластеров мтДНК. Статистическую значимость различий между частотами мутаций в мутационных спектрах ГВС1 мтДНК определяли с помощью t-теста (пакет STATISTICA/w 5.0). Статистический анализ модели дислокационного мутагенеза ДНК проводили с помощью програм­мы CONSEN [19, 20]. Эта модель основана на предположении о том, что смещение цепей ДНК на участках повторяющихся последовательнос­тей в процессе репликации может приводить к по­следующему быстрому выравниванию последо­вательностей с появлением неспаренных основа­ний на месте смещения одной из цепей [21].


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

К настоящему времени получен очень боль­шой массив данных об изменчивости ГВС1 мтДНК в популяциях человека. Например, толь­ко база данных "mtradius" [22] включает более 17 000 индивидуальных нуклеотидных последова­тельностей. Однако, как показывает анализ опуб­ликованных данных, число последовательностей ГВС1 с известным филогенетическим статусом, установленным с помощью дополнительного ана­лиза полиморфизма кодирующих участков мито-хондриального генома, существенно ниже. Нами создана и изучается база данных, представленная 7482 нуклеотидными последовательностями ГВС1 (между позициями 16092-16365), которые отно­сятся к 88 филогенетическим группам мтДНК, распространенным среди населения Африки и Евразии. Западноевразийские выборки представ­лены населением различных регионов Европы и Западной Азии, восточноевразийские, в основном, населением Северной Азии (Сибири и Централь­ной Азии), митохондриальный генофонд которой изучен наиболее полно, а африканские выборки -населением различных регионов Африки. Генофонд западноевразийских популяций ха­рактеризуется типами мтДНК, которые в составе монофилетических кластеров HV, TJ и U относят­ся к макрогруппе R, а в составе кластеров N1, W и X - к макрогруппе N [13]. Эти макрогруппы обо­значены нами R(WEA) и N(WEA). В генофондах восточноевразийских популяций наибольшее распространение получили типы мтДНК из мак­рогруппы M, но распространены и типы мтДНК, относящиеся к макрогруппам R и N. Однако вос-точноевразийские линии R и N принадлежат к не­свойственным для населения Европы и Западной Азии кластерам B и R9 в составе R(EEA), A и N9 в составе N(EEA) [16, 17]. В генофондах популя­ций Африки распространены в основном группы мтДНК, входящие в макрогруппу L, и лишь в се­веро-восточных популяциях встречаются группы U6 и M1 [5]. Однако последние мы не рассматри­вали, так как они имеют евразийское происхож­дение [4, 23].

Анализ мутационного спектра ГВС1, реконст­руированного по L-цепи кембриджской последо­вательности мтДНК, у представителей трех реги­ональных групп населения показал, что из 274 проанализированных позиций ГВС1 вариабель­ными являются 202, в которых произошли 2212 мутаций. Эти мутации относятся преимуществен­но к транзициям, а соотношение числа транзиций к трансверсиям составляет 14 : 1. Значение этого па­раметра несколько варьирует в мутационных спе­ктрах региональных групп населения: в популяци­ях Западной Евразии - 13.5 : 1, Африки - 14 : 1, Восточной Евразии - 15.8 : 1. Рассматривая рас­пределение транзиций в отдельных филогеографических группах мтДНК (табл. 1),

 можно ви­деть, что в спектрах ГВС1 наиболее распростра­нены пиримидиновые транзиции, число которых в 3.4 раза превышает число пуриновых транзиций в региональных группах Африки и Западной Евра­зии и в 2.9 раза среди населения Восточной Евра­зии. Информативным является показатель соотно­шения числа вариабельных позиций и мутаций, произошедших в них. Этот показатель оценивает мутационное давление на нуклеотид. Значения этого показателя высоки для всех нуклеотидов, за исключением аденина. Кроме этого, пониженное в сравнении с остальными региональными группами мутационное давление на цитозины наблюдается в восточноевразийской группе (2.9 против 6.0).Необходимо отметить, что вариабельность нук-леотидов (по числу полиморфных позиций) до­стоверно коррелирует с их содержанием в ГВС1 (r = 0.99) - чем более распространены нуклеоти-ды определенного типа, тем более они вариабель­ны. Однако распределение показателей мутаци­онного давления не соответствует нуклеотидному составу. Так, адениновые основания, которые на­ряду с цитозиновыми (34.7 и 35% соответственно) наиболее часто встречаются в L-цепи ГВС1 мтДНК, испытывают минимальное мутационное давление по сравнению со всеми остальными нуклеотидами (табл. 1). Между тем, гуанин, доля ко­торого мала (всего 9.1%), характеризуется высо­ким мутационным давлением (не менее пяти неза­висимых мутаций на полиморфную G-позицию).

Результаты сравнительного анализа мутаци­онных спектров ГВС1 мтДНК в трех региональ­ных группах человека свидетельствуют о сущест­вовании нуклеотидных позиций, вариабельных во всех трех сравниваемых группах. В табл. 2 указа­ны 18 таких позиций, каждая из которых хотя бы в одной из филогеографических групп мтДНК яв­ляется "горячей" точкой, т.е. характеризуется не­зависимым возникновением в разных группах мтДНК более 10 раз [24]. Из этих позиций наибо­лее"горячие" - 16093, 16129, 16189, 16311, 16362, идентичные мутации в которых обнаружены бо­лее 10 раз в каждом из региональных спектров мутаций ГВС1 мтДНК, т.е. в 28 группах мтДНК населения Западной Евразии, в 34 группах мтДНК населения Восточной Евразии и 26 груп­пах мтДНК населения Африки. Важно отметить, что изученные мутационные спектры достоверно (p < 0.05) различаются по частоте возникновения мутаций в определенных позициях ГВС1 (табл. 3). 

В ячейках табл. 3, расположенных по горизонта­ли, указаны нуклеотидные позиции, мутации в которых возникали достоверно чаще лишь в од­ной из трех сравниваемых региональных групп. Наибольшее число таких позиций зарегистриро­вано в западноевразийском мутационном спект­ре. Результаты, представленные в табл. 3, свиде­тельствуют о том, что в западноевразийском спе­ктре мутации в 35 позициях возникали чаще, чем в восточноевразийском и в 21 позиции - чаще, чем в африканском спектре. В африканском спек­тре выявлены 3 и 20 позиций, по частоте мутаций в которых этот спектр отличается от западно- и восточноевразийского спектров соответственно. В восточноевразийском мутационном спектре от­мечена лишь одна позиция (16319), в которой му­тации возникали чаще в сравнении с африканским спектром. В ячейках, расположенных по диагона­ли, указаны нуклеотидные позиции, вариабельные только в одной из региональных групп. Мутации в этих позициях являются, таким образом, уни­кальными (их количество составляет 15, 7 и 2 для западноевразийского, африканского и восточное­вразийского спектров соответственно). Подоб­ные уникальные регион-специфичные мутации, возникшие независимо в двух и более кластерах мтДНК, распространены во всех трех анализиру­емых спектрах ГВС1. Примечательно, что среди уникальных регион-специфичных мутаций вели­ка доля трансверсий (до 70%, как в африканском спектре, где пять из семи мутаций представлены трансверсиями). Таким образом, полученные данные однознач­но свидетельствуют о том, что мутационные спе­ктры ГВС1 мтДНК трех региональных групп че­ловека достоверно отличаются по частоте появ­ления мутаций в определенных нуклеотидных позициях. Более того, за время раздельной эволю­ции митохондриальных генофондов, дивергенция которых началась десятки тысяч лет тому назад, некоторые нуклеотидные позиции приобрели не­стабильность лишь в определенных филогеографических (региональных) группах мтДНК. При­чины этого неясны. Как уже отмечалось, ранее [10] были обнаружены различия в распределении несинонимических мутаций в генах митохондриального генома в филогеографических группах мтДНК, распространенных в популяциях тропической, умеренной и арктической зон, и эти раз­личия объяснялись действием отбора, которым сопровождалась адаптация популяций. В любом случае, однако, необходимо более глубокое пони­мание молекулярных механизмов появления мута­ций и "горячих" точек в митохондриальном геноме. 

Проведенные нами ранее исследования пока­зали, что механизмы возникновения мутаций в главной некодирующей области мтДНК опреде­ляются в значительной мере контекстом ДНК [24, 25]. Один из наиболее значимых механизмов -это смещение (дислокация) цепей ДНК на участ­ках однонуклеотидных последовательностей или участках, способных к формированию вторич­ных структур типа шпилек и петель, в процессе репликации ДНК. Так, модель дислокационного мутагенеза объясняет появление 20% "горячих" точек в ГВС1 [24].
Анализ мутационного спектра ГВС1, рассмот­ренного в нашей работе, показал, что появление 23.4% мутаций (517 из 2212), возникших в 34.7% вариабельных позиций (70 из 202), также можно объяснить в рамках модели дислокационного му­тагенеза. 

В табл. 4 приведен полный список пози­ций, в которых возникают дислокационные мута­ции в ГВС1 мтДНК. В анализе мутаций, располо­женных вблизи от позиции 16223, мы учитывали варианты контекста, определяемые наличием T или C в позиции 16223. Например, корневые по­следовательности групп Z и K имеют, соответст­венно, вид 16185-16223-16224-16260-16298 и 16224-16311 (транзиции записаны относительно последовательности кембриджской мтДНК). В данном случае мутация в позиции 16224 возникала дважды на разном контексте ближайшего нукле­отидного окружения - в группе Z в позиции 16223 находится тимин, в группе K - цитозин. В обоих случаях наиболее вероятным представляется воз­никновение транзиции в позиции 16224 в резуль­тате дислокационного мутагенеза, однако причины его различны. Так, в случае К-последовательностей транзиция в позиции 16224 образуется на контексте R-корневой последовательности - от CCCTCAA к CCCCCAA  (позиция 16224 выделена, дислокацион­ный участок подчеркнут). В Z-последовательностях транзиция в позиции 16224 возникает на контексте M-корневой последовательности - от  CCTTCAA к CCTCCAA.
В списке дислокационных мутаций (табл. 4) выделены мутации, наблюдаемые в региональ­ных спектрах мутаций ГВС1 мтДНК (табл. 3). Следует отметить, что доля позиций, в которых возникают дислокационные мутации, составила 34.5% (19 из 55) и 16.7% (4 из 24) соответственно в западноевразийском и африканском спектрах (дислокационные мутации, соответствующие от­дельным региональным спектрам, указаны в табл. 4). Единственная позиция (16319), мутации в которой достоверно чаще возникают в восточно-евразийских группах мтДНК в сравнении с афри­канскими, также относится к числу позиций, под­верженных дислокационному мутагенезу. Таким образом, модель смещения цепей мтДНК в про­цессе репликации митохондриального генома способна объяснить происхождение целого ряда мутаций в региональных спектрах мтДНК, одна­ко разнообразие механизмов генерирования му­таций в митохондриальном геноме очевидно вы­ше, в связи с чем необходимо дальнейшее изуче­ние этой важной проблемы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.    Anderson S., Bankier A.T., Barrel B.G. et al. 1981. Se­quence and organization of the human mitochondrial ge­nome. Nature. 290, 457-465.

2.    Wallace D.C. 1995. Mitochondrial DNA variation in hu­man evolution, degenerative disease and aging. Am. J. Hum. Genet. 57, 201-223.

3.    Watson E., Forster P., Richards M., Bandelt H.-J. 1997. Mitochondrial footprints of human expansions in Africa. Am. J. Hum. Genet. 61, 691-704.

4.    Quintana-Murci L., Semino O., Bandelt H.-J. et al. 1999. Genetic evidence for an early exit of Homo sapiens sapi­ens from Africa through eastern Africa. Nature Genet.

23, 437-441.

5. Salas A., Richards M., De la Fe T. et al. 2002. The mak­ing of the African mtDNA landscape. Am. J. Hum. Gen­et. 71, 1082-1111.

Excoffier L. 1990. Evolution of human mitochondrial DNA: evidence for departure from a pure neutral model of populations at equilibrium. J. Mol. Evol. 30, 125-139.

Малярчук Б.А., Деренко М.В. 1995. Полиморфизм региона V митохондриальной ДНК у коренного и пришлого населения Северо-Восточной Азии. Ге­нетика. 31, 1308-1313.

Малярчук Б.А., Соловенчук Л.Л. 1997. Отрица­тельная связь между разнообразием ядерного и митохондриального геномов в популяциях аркти­ческих монголоидов Северо-Восточной Азии. Ге­нетика. 33, 532-538.

Torroni A., Rengo C., Guida V. et al. 2001. Do the four clades of the mtDNA haplogroup L2 evolve at different rates? Am. J. Hum. Genet. 69, 1348-1356.

Mishmar D., Ruiz-Pesini E., Golik P. et al. 2003. Natural selection shaped regional mtDNA variation in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 171-176.

Moilanen J.S., Majamaa K. 2003. Phylogenetic network and physicochemical properties of nonsynonymous mu­tations in the protein-coding genes of human mitochon-drial DNA. Mol. Biol. Evol. 20, 1195-1210.

Малярчук Б.А., Деренко М.В. 2001. Изменчивость митохондриальной ДНК человека: распределение "горячих точек" в гипервариабельном сегменте I главной некодирующей области. Генетика. 37, 991-1001.

13.

Richards M., Macaulay V., Hickey E. et al. 2000. Trac­ing European founder lineages in the Near Eastern mtDNA pool. Am. J. Hum. Genet. 67, 1251-1276.

14.

Derbeneva O.A., Starikovskaya E.B., Wallace D.C., Sukernik R.I. 2002. Traces of early Eurasians in the Mansi of Northwest Siberia revealed by mitochondrial DNA analysis. Am. J. Hum. Genet. 70, 1009-1014.

15.

Дербенева О.А., Стариковская Е.Б., Володь-ко Н.В. и др. 2002. Изменчивость митохондриаль-ной ДНК у кетов и нганасан в связи с первоначаль­ным заселением Северной Евразии. Генетика. 38,

1554-1560.

16.    Kivisild T., Tolk H.-V., Parik J. et al. 2002. The emerg­ing limbs and twigs of the East Asian mtDNA tree. Mol. Biol. Evol. 19, 1737-1751.

17.    Yao Y.-G., Kong Q.-P., Bandelt H.-J. et al. 2002. Phylo-genetic differentiation of mitochondrial DNA in Han Chinese. Am. J. Hum. Genet. 70, 635-651.

18.    Derenko M.V., Grzybowski T., Malyarchuk B.A. et al. 2003. Diversity of mitochondrial DNA lineages in South Siberia. Ann. Hum. Genet. 67, 391-411.

19.    Rogozin I.B., Kolchanov N.A. 1992. Somatic hypermu-tagenesis in immunoglobulin genes. II. Influence of neighbouring base sequences on mutagenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1171, 11-18.

20.    Rogozin I.B., Kondrashov F.A., Glazko G.V. 2001. Use of mutation spectra analysis software. Hum. Mutat. 17,

83-102.

21.    Kunkel T.A., Soni A. 1988. Mutagenesis by transient misalignment. J. Biol. Chem. 263, 14784-14789.

21.    Forster P., Cali F., Rohl A. et al. 2002. Continental and subcontinental distributions of mtDNA control region types. Int. J. Legal Med. 116, 99-108.

22.    Macaulay V., Richards M., Hickey E. et al. 1999. The emerging tree of West Eurasian mtDNAs: a synthesis of control-region sequences and RFLPs. Am. J. Hum. Gen­et. 64, 232-249.

24.    Malyarchuk B.A., Rogozin I.B., Berikov V.B., Derenko M.V. 2002. Analysis of phylogenetically reconstruct­ed mutational spectra in human mitochondrial DNA control region. Hum. Genet. 111, 46-53.

25.    Малярчук Б.А. 2002. Роль контекста в возникнове­нии мутаций в гипервариабельном сегменте 1 митохондриальной ДНК человека. Молекуляр. био­логия. 36, 418-423.