«Ласковый убийца» под прицелом Миравирсена

Статья на конкурс «био/мол/текст»: 20 лет прошло с момента открытия первой микроРНК. Еще немногим раньше, в 1989 году, люди научились диагностировать гепатит С, часто называемый «ласковым убийцей». «И как же связаны эти два события?» — спросите вы. А связь в том, что лекарство нового поколения Миравирсен, чей принцип действия основан на знаниях о микроРНК, будет излечивать людей от этого страшного вируса. Но как исследователи смогли создать такой препарат?

SPC3649 или Миравирсен – лекарство нового поколения против гепатита С.

Открытие

Ровно 20 лет назад, в 1993 году, Виктор Амброс (Victor Ambros) [1] и Гэри Рувкин (Gary Ruvkin) [2] открыли первый ген микроРНК (или на английском miR) lin-4 в геноме нематоды C. elegans, а также показали, что мутация по этому гену приводит к нарушению развития червя во взрослое животное. Их статьи опубликовали в одном номере журнала Cell [1, 2]. Долгое время lin-4 считался неясной аномалией генома, пока в 2000 году не обнаружили малую регуляторную РНК let-7. Искусственного заблокировав функции let-7, можно получить червей, у которых не происходит формирования энтодермы при одновременной активации формирования мезодермы и эктодермы из эмбриональных стволовых клеток [3]. С этого момента исследователи окончательно осознали, что микроРНК не просто транскрипционный «шум», а важный регулятор в клетке, и занялись поиском аналогичных элементов в геномах дрозофилы, человека и т.д. К 2011 году у животных, растений и вирусов было аннотировано 18226 микроРНК, включая 1921 в человеческом геноме [4]. Не правда ли, неплохой результат за 10 лет исследований? (Более подробно про механизмы работы и классификацию микроРНК «биомолекула» уже писала: «Обо всех РНК на свете, больших и малых» [5]).

Locked nucleic acid

Рисунок 1. Общая формула LNA — locked nucleic acid. При замене X на кислород, а Y — на серу, получают так называемые фосфоротиоатные «закрытые» нуклеотиды [6, 7].

Вот небольшое отступление, касающееся инструментов, которые используются в работе с микроРНК. В 1998 году исследователь Кошкин добавил к инструментарию молекулярной биологии технику создания «закрытых» нуклеиновых кислот [6] (LNA — locked nucleic acid). Что же кроется за этим названием?

• LNA — это бициклический аналог РНК, рибозное кольцо которого находится в C3’-эндо конформации, благодаря появлению 2’-O,4’-C метиленового мостика (рис. 1). 
• Модифицированные таким образом нуклеотиды демонстрируют высокие термостабильность и сродство в дуплексе с целевыми молекулами РНК. 
• LNA очень специфичны в вопросе «отлавливания» малых РНК, в частности, микроРНК.

В последующие годы ученые активно использовали LNA в нозерн-блоттинге, in situ-гибридизации, а также whole-mount in situ-гибридизации, что привело в 2006 году к появлению такого термина как antimiR. АнтимиР-ами были названы LNA-аналоги антисмысловых олигонуклеотидов, способные ингибировать функцию микроРНК в культуре клеток [7]. В основе этого ингибирования лежит принцип Уотсон-Криковских взаимодействий.

И вот, к 2005 году стало ясно, что информации о микроРНК накопилось достаточно для того, чтобы приступить к созданию лекарства следующего поколения. Во-первых, результаты исследований явно указывали, что нарушения регуляции микроРНК ведут к заболеваниям*. Во-вторых, успешное применение технологии «закрытых» нуклеиновых кислот (LNA; см. врезку) обеспечит практически беспроблемный дизайн антимиР-олигонуклеотидов (особый тип РНК; см. врезку) для фармакологического ингибирования нужных микроРНК in vivo. Почему практически? Под вопросом оставался сущий пустяк: как осуществить доставку в желаемое место в организме?

* — Например, ослабление функций miR-14 существенно увеличивает общее содержание триацилглицеридов; miR-278осуществляет контроль продукции инсулина, а делеция miR-278 стимулирует данный процесс; повышенная экспрессияmiR-1, специфичной для сердца, ингибирует кардиомиоциты во время его эмбриогенеза и провоцирует аритмогенез [16].

Тут внимание исследователей привлекает miR-122:

• miR-122 отличается не только полной консервативностью у всех позвоночных от рыбок Данио до человека, но и высокой концентрацией в печени; 
• также ученые вспомнили, что антимиР олигонуклеотиды с фосфоротиоатным (PS) каркасом накапливаются опять же в печени, причем для этого не нужны никакие дополнительные модификации; 
• кульминационным аккордом стало сообщение Питера Сарнова (Peter Sarnow) в 2005 году [12], что экспрессированная в печени miR-122 взаимодействует с РНК вируса гепатита С. Все факты говорили о том, что miR-122 — важнейший внутренний фактор размножения гепатита С [8].

Вот так зародилась идея по созданию первого в мире лекарства на основе микроРНК, которое поможет излечиться 170 миллионам людей, зараженным гепатитом С [10]. С этого момента началась история создания Миравирсена.

В двух словах про гепатит С

Рисунок 2. Строение вирусной частицы гепатита С (по [9], с изменениями).

Рисунок 3. Структура генома вируса гепатита C. Геном состоит 5’- и 3’-НТО и областей со структурными (C, E1, 2) и неструктурными (NS1, 2, 3, 4A,4B, 5A, 5B) белками. Особый интерес для исследователей представляют 5’-НТО и NS3, 4A [9].

Рисунок 4. Цена Incivek^® (телапривира) в интернет-магазине [15].

Этиология

Впервые вирус гепатита С был обнаружен в 1989 году. По классификации он принадлежит к роду Hepacivirus семейства Flaviviridae. Представляет собой маленький(40-60 нм в диаметре), оболочечный, одноцепочечный, +РНК вирус. Состоит из РНК, помещенной в икосаэдрический белковый капсид, который, в свою очередь, защищен липидной оболочкой (рис. 2). Геном вируса состоит из единственной открытой рамки считывания длиной примерно 9600 п.н.о. (рис. 3). Известно 6 генотипов с подтипами и квазивидами гепатита С. Распространение того или иного вида зависит от географического расположения [9].

Эпидемиология

По данным ВОЗ, более 170 миллионов человек инфицированы гепатитом С, что составляет 3% всего населения Земли. Чаще всего вирус гепатита С передается при воздействии инфицированной крови. Это может происходить следующими путями (информация с сайта ВОЗ [14]):

• при переливании зараженной крови и продуктов крови и при пересадке органов; 
• при инъекциях загрязненными шприцами и травмах от укола иглой в медицинских учреждениях; 
• при употреблении инъекционных наркотиков; 
• новорожденному ребенку от инфицированной гепатитом С матери. 
• Гепатит С может передаваться при сексуальных контактах с инфицированным человеком или при совместном пользовании личными предметами, загрязненными инфицированной кровью, но это происходит реже. 
• гепатит С не передается с грудным молоком, через пищевые продукты или воду и при безопасных контактах, таких как объятия, поцелуи или совместное употребление в пищу продуктов и напитков с инфицированным человеком.

Острое инфекционное состояние. Во время острой фазы, которая длится около полугода, у 60–70% инфицированных не развивается никаких симптомов, что затрудняет своевременную постановку диагноза. 15–25% инфицированных смогут избавиться от вируса самостоятельно, у остальных гепатит С перейдет в хроническую стадию. Хроническое состояниетакже бессимптомно, пока не станут заметны явные повреждения в печени. В итоге болезнь обнаруживают, когда пациент страдает от цирроза, рака печени или вовсе полного отказа органа. Поэтому в народе гепаптит С окрестили «ласковым убийцей». По данным эпидемиологических исследований на гепатит С вместе со своим «собратом» гепатитом В приходится ¾ всех болезней печени.

Лечение

Золотым стандартом лечения на данный момент принят пегинтерферон-α (интерферон-α+полиэтиленгликоль) в комбинации с рибавирином. Из побочных эффектов: зуд, заложенность носа. Основные проблемы пегинтерферонов и рибавирина — это высокая заболеваемость, симптомы как при гриппе, усталость. Такие побочные эффекты, конечно, никому не нравятся, так как снижают качество жизни, работоспособность. Люди часто отказываются от лечения, особенно в бессимптомный период, что сводит возможность выздоровления к минимуму.
Но арсенал фармацевтических компаний этим не исчерпываются. В 2011 году на рынок поступили новые препараты: ингибиторы вирусной протеазы NS3/4A Incivek^® (телапревир) и Victrelis^® (боцепревир) [9]. Протеазные ингибиторы могут служить субстратами для цитохрома Р-450, а такие «пересечения» в метаболических цепочках приводят к нежелательным взаимодействиям между веществами. Само по себе создание и производство подобной протеазы было задачей непростой и дорогостоящей. Для нашей страны цена препарата неподъёмная (рис. 4): курс телапревира стоит 250 тысяч рублей! И завершающая ложка дегтя: эти препараты вызывают анемию, что очень отдаляет их от идеала.

Миравирсен. Доклинические исследования

Миравирсен (продукт компании Santaris Pharma) представляет собой LNA-antimiR™ олигонуклеотид, которому присвоено название miravirsen sodium [13] (соль натрия — желтовато-белый гигроскопичный порошок). Его состав — восемь D-oxy-LNA и семь ДНК-нуклеотидов в следующей последовательности: 5’-mC-c-A-t-t-G-T-c-a-mC-am-C-t-mC-mC-3‘ (заглавные буквы — LNA, строчные — ДНК).

Молекулярная формула	C151H171N49Na14O83P14S14
Молекулярный вес	5204.65 г/моль
Название молекулы	SPC3649

miR-122 — самая распространенная микроРНК в гепатоцитах — регулирует образование энергии, липидный и стероидный обмен и репликацию гепатита С. miR-122 — жизненно важный фактор для вируса: без нее гепатит С не способен эффективно размножаться. Интересный факт: если сделать инъекцию miR-122 в негепатоцитные клетки, то вирус гепатита С станет реплицироваться и там.

Как же miR-122 взаимодействуют c геномом гепатита С? Известно, что +РНК вируса содержит два практически идентичных сайта — S1 и S2, — расположенные в 5’-нетранслируемой области (НТО) вирусного генома (рис. 5А). Они связываются с двумя miR-122, и образовавшийся комплекс защищает вирусную РНК от нуклеаз и иммунной системы в гепатоцитах (рис. 5В). Сайты для связывания miR-122 сохраняют свою консервативность среди всех известных генотипов и подтипов гепатита С.

Рисунок 5. Механизм действия miR-122 и Миравирсена. А. В 5’-НТО генома гепатита С расположены два сайта, комплементарные miR-122, — S1 и S2. С ними и взаимодействует микроРНК, стимулируя репликацию. В. Миравирсен образует комплекс с miR-122, которая таким способом становится недоступной вирусу [10].

Другие «олиги»

Миравирсен далеко не уникальный в своем роде лекарственный препарат. В разработке сейчас находится еще десяток олигонуклеотидов, чей принцип действия основан на ингибировании соответствующих микроРНК. Например, Мипомерсен ингибирует экспрессию аполипопротеина В-100 в печени и применяется в лечении семейной гиперхолестеринемии [8].

Миравирсен синтезирован таким образом, чтобы специфически подавлять miR-122, образуя дуплекс. Как только miR-122 становится недоступной для вируса, его распространение полностью подавляется.

Окончательный вариант формулы появился не сразу. Во-первых, создали небольшую библиотеку олигонуклеотидов длиной 13–16 нт с минимальной температурой плавления 60 °С. Во-вторых, исключили комплементарность первого нуклеотида микроРНК, так как исследования показали, что этот нуклеотид «прячется» в особом сайте белка Argonaute. В-третьих, чтобы предотвратить возможное разрезание комплексом RISC (RNA-induced silencing complex [5]) потенциальных сайтов, были введены замены на LNA-нуклеотиды. Не забыли и про PS-скелет и комплементарность 5’-НТО вирусного генома. После экспериментов на человеческих линиях клеток гепатотоцитов в лидеры вышел олигонуклеотид под названием SPC3649. Именно SPC3649 вошел в историю под названием Миравирсен.

Первым делом новый препарат испробовали на мышах, и весьма успешно. Животным вкалывали внутрибрюшинно от 12,5 до 75 мг/кг/доза два раза в неделю и через четыре недели достигли ингибирования miR-122. Тем временем исследователи обратили внимание, что параллельно с miR-122 в плазме крови снижается уровень холестерина (на 30–40%) и сочли, что это очень удобный биомаркер [8]. Исследования на животных и некоторых приматах не выявили побочных эффектов. Итак, краткосрочное ингибирование miR-122 было признано безопасным [8].

Миравирсен. Клинические исследования

В 2010 году канадская фармацевтическая компания Santaris Pharma A/S приступила к клиническим испытаниям на пациентах, инфицированных гепатитом С. По данным от мая 2013 года Миравирсен™ находится на стадии IIa клинических испытаний. Уже известно, что у четырех из девяти пациентов после курса инъекций Миравирсена РНК вируса в крови не обнаруживалась (рис. 6); серьезных побочных эффектов при этом не выявлено [11]. Предполагается, что препарат будет необходимо принимать раз в несколько недель [8].

По оценкам маркетологов, цена лекарства будет доступной благодаря простоте LNA-технологий. С их помощью можно синтезировать вещество в больших количествах и дешево. К 2018 году ожидается настоящая сенсация, когда Миравирсен™ появится на полках аптек.

Рисунок 6. Клинические испытания Миравирсена. На графике представлены четыре группы пациентов, принимавших участие в клинических испытаниях: плацебо, 3, 5 и 7 мг/кг. Хорошо заметны: а) положительная динамика при высоких концентрациях и б) падение титра вирусной РНК [8].

Литература

1. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75, 843–854; 
2. Wightman B., Ha I., Ruvkun G. (1993). Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75, 855–862; 
3. База знаний по биологии человека Humbio «МикроРНК (miRNA) lin-4 и микроРНК let-7»; 
4. Kozomara A.., Griffiths-Jones S. (2011). miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Res. 39, D152—157; 
5. биомолекула: «Обо всех РНК на свете, больших и малых»; 
6. Kumar R., Singh S.K., Koshkin A.A., Rajwanshi V.K., Meldgaard M., Wengel J. (1998). The first analogues of LNA (locked nucleic acids): phosphorothioate-LNA and 2’-thio-LNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 2219–2222; 
7. Ørom U.A., Kauppinen S., Lund A.H. (2006). LNA-modified oligonucleotides mediate specific inhibition of microRNA function.Gene 372,137—141; 
8. Janssen H.L., Reesink H.W., Lawitz E.J., Zeuzem S., Rodriguez-Torres M., Patel K., van der Meer A.J., Patick A.K., Chen A., Zhou Y., Persson R., King B.D., Kauppinen S., Levin A.A., Hodges M.R. (2013). Treatment of HCV Infection by Targeting MicroRNA. N. Engl. J. Med. 368, 1685–1694; 
9. Santaris Pharma. (2011). Miravirsen (SPC3649). A New Treatment Targeting Hepatitis C; 
10. Lindow M., Kauppinen S. (2012). Discovering the first microRNA-targeted drug. J. Cell. Biol. 199, 407–412; 
11. BMJ (2013). Miravirsen works against hepatitis C virus. BMJ 346, f2069; 
12. Jopling C.L., Yi M., Lancaster A.M., Lemon S.M., Sarnow P. (2005). Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science 309, 1577–1581; 
13. SPC3649 — Compound Summary NCBI PubChem; 
14. Всемирная Организация Здравоохранения: Гепатит С: информационный бюллетень; 
15. Likitoria: ИНСИВЕК (Телапревир) / INCIVEK INCIVO (Telaprevir) 42; 
16. Иммунология: новости, статьи, аналитика — «Перспективы изучения и применения микроРНК в иммунологии и аллергологии».

http://biomolecula.ru/content/1228

Автор: Цымбаревич Ирина.