Выявлен белок, отвечающий за своевременное включение генов у эмбрионов
Рис. 1. Эмбрионы рыбки данио-рерио через 24 часа после оплодотворения. Слева — мутантные эмбрионы, лишенные белка pou5f1: развитие полностью нарушено; справа — нормальные эмбрионы («дикий тип»); в центре — мутантные эмбрионы, которым сделали инъекцию мРНК Pou5f1 мыши: мышиный белок позволил эмбрионам-мутантам развиваться почти нормально, что свидетельствует об эволюционной консервативности данного регулятора (и он сам, и его функция мало изменились со времени расхождения предков рыб и мышей). Из статьи Onichtchouk et al., 2010. Zebrafish Pou5f1-dependent transcriptional networks in temporal control of early development
Ранние этапы эмбрионального развития животных идут под контролем материнских генов, а гены самого эмбриона остаются выключенными. Важнейшим переломным моментом является «переход от материнского типа экспрессии генов к зиготическому» (МЗП), в ходе которого в клетках эмбриона одновременно включаются десятки генов-регуляторов, которые берут на себя управление дальнейшим развитием. Германские ученые показали, что у рыбки данио-рерио переход с «материнской» программы развития на «зиготическую» управляется белком Pou5f1. Ранее про него было известно, что он работает в эмбриональных стволовых клетках млекопитающих, поддерживая их плюрипотентность (способность превращаться в специализированные клетки различных типов). Как выяснилось, Pou5f1 заранее (еще до МЗП) прикрепляется к регуляторным участкам множества генов — регуляторов развития, поддерживая их в состоянии «боевой готовности», благодаря чему они могут быстро включиться, как только будут получены соответствующие команды от других регуляторных белков или РНК. У насекомых аналогичную функцию выполняет другой, неродственный белок — Zelda. По-видимому, специальные регуляторные системы, способствующие минимизации хаоса в ходе МЗП, развивались у разных животных на разной молекулярной основе.
Эмбриональное развитие животных стартует при отключенном геноме. Первые этапы развития контролируются продуктами материнских генов (белками и мРНК), синтезированными еще в ходе созревания яйцеклетки. Затем в какой-то момент в клетках эмбриона дружно включаются десятки генов-регуляторов, а материнские мРНК уничтожаются. В результате эмбрион переключается с «материнской» программы развития на свою собственную. Этот переломный момент называют «переходом от материнского типа экспрессии генов к зиготическому» (МЗП, maternal-to-zygotic transition, MZT). У разных животных он происходит в разное время. У млекопитающих гены эмбриона включаются очень рано — после первого деления зиготы, на стадии двух клеток, а у рыб — намного позже, после 10 делений, когда эмбрион состоит примерно из 1000 клеток и находится на стадии бластулы. В поведении клеток зародыша до и после МЗП есть существенные различия: после МЗП клеточные деления перестают быть синхронными, а клетки начинают дифференцироваться — развиваться разными путями, чтобы дать начало разным зародышевым листкам, тканям и органам.
Механизмы МЗП пока во многом неясны (см.: Нужны ли эмбрионам гены?, «Элементы», 08.05.2007). Так, до сих пор неизвестно, есть ли у животных универсальная система стабилизации МЗП, обеспечивающая материнско-зиготическому переходу надежность и устойчивость (robustness), то есть быстроту, слаженность и пониженный уровень хаотичности в изменениях активности генов. Интуитивно ясно, что переход системы, управляемой одной программой развития, под контроль другой программы — дело рискованное. По-видимому, выключить первую программу и включить вторую нужно быстро, одновременно и сразу, а не по частям. Вряд ли система будет нормально работать, пока ей управляет некая комбинация фрагментов недовыключенной первой программы и недовключенной второй. Между тем, в процессе активации генов всегда есть элемент хаотичности — это следует хотя бы из того, каким способом белки-регуляторы (транскрипционные факторы), отвечающие за включение и выключение генов, ищут подконтрольные им участки (сайты связывания транскрипционных факторов) в молекулах ДНК (см.: Работу регуляторного белка впервые пронаблюдали под микроскопом, «Элементы», 31.05.2007).
Поэтому можно предположить, что специальные молекулы-регуляторы должны держать в состоянии «повышенной боевой готовности» те гены в хромосомах эмбриона, которые берут на себя управление ходом развития во время МЗП. Такой регулятор — транскрипционный фактор Zelda — ранее был обнаружен у дрозофилы. Белок Zelda избирательно связывается с регуляторными участками «ранних» эмбриональных генов, которые должны включаться первыми в ходе МЗП, и обеспечивает быстроту и слаженность их активации. Но за пределами класса насекомых не удалось обнаружить белков, гомологичных Zelda. Поэтому вопрос о наличии подобных систем у других животных оставался открытым.
Дарья Онищук и Вольфганг Дривер (Wolfgang Driever) из Университета Фрайбурга (Германия), изучающие развитие рыбки данио-рерио (zebrafish), обратили внимание на белок Pou5f1, всегда присутствующий в яйцеклетках и ранних эмбрионах этого модельного животного. Сначала Pou5f1 производится на основе материнских мРНК, а затем начинает работать собственный ген Pou5f1 эмбриона. Интерес к Pou5f1 возник в связи с изучением эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) млекопитающих. Белок Pou5f1 является ключевым транскрипционным фактором, поддерживающим плюрипотентноесостояние ЭСК, то есть их способность превращаться в клетки тех или иных тканей в ответ на соответствующие химические сигналы. Известно, что в ЭСК млекопитающих Pou5f1 образует комплекс с белком Sox2, и вместе они присоединяются к регуляторным участкам многих генов — регуляторов развития. У комплекса Pou5f1-Sox2 есть свой специфический сайт связывания (SOX-POU), состоящий из двух частей: одна для прикрепления Pou5f1, другая для Sox2.
Чем же занимается Pou5f1 в рыбьих эмбрионах? Авторы показали, что этот белок абсолютно необходим для нормального развития рыб. У эмбрионов, лишенных Pou5f1 (и материнского, и своего собственного), весь онтогенез начиная со стадии бластулы идет вкривь и вкось: гены включаются несинхронно и с большими задержками, клетки не могут нормально дифференцироваться, ткани и органы не образуются там, где им положено, так что в итоге вместо зародыша с хвостом, хордой, сомитами и всем прочим получается бессмысленный комок клеток, который вскоре погибает (рис. 1, слева). Однако мутантный эмбрион можно «спасти», если своевременно сделать ему инъекцию белка Pou5f1 (точнее, не самого белка, а матричной РНК, его кодирующей). Самое интересное, что такой спасительный эффект оказывает не только рыбья, но и мышиная версия Pou5f1! Это значит, что структура и функция Pou5f1 весьма консервативны — мало менялись в ходе эволюции позвоночных.
Затем авторы при помощи метода ChIP-sequencing выявили в геноме данио несколько тысяч участков, к которым прикрепляется Pou5f1 до, во время и после МЗП. Во многих случаях по соседству с Pou5f1 на ДНК сидит также и Sox2 (причем до МЗП такое соседство наблюдается реже, чем после). Дальнейший анализ показал, что Pou5f1 и Sox2 прикрепляются к сайтам связывания, очень похожим на двойной сайт SOX-POU млекопитающих. Наборы «подконтрольных» генов, рядом с которыми расположены эти сайты, тоже оказались сходными у эмбрионов данио-рерио и в ЭСК мышей и людей. Между прочим, к числу генов, регулируемых комплексом Pou5f1-Sox2, относятся и гены самих Pou5f1 и Sox2, так что система эта — саморегулирующаяся.
Ранее авторы получили подробные данные по уровню экспрессии (активности) многих генов данио-рерио на разных этапах развития. Теперь эти данные пригодились для того, чтобы показать: чаще всего Pou5f1 и Sox2 прикрепляются к ДНК около генов, активность которых резко возрастает именно во время МЗП (через 3–4 часа после оплодотворения), то есть около тех самых генов, которые берут на себя управление развитием после завершения работы «материнской» программы.
Дальнейшие эксперименты подтвердили, что Pou5f1 (иногда в комплексе с Sox2 или другими вспомогательными белками) задолго до начала МЗП прикрепляется к регуляторным участкам множества ключевых генов — регуляторов развития. Pou5f1 приводит их в состояние «повышенной боеготовности», позволяя им включиться быстро и своевременно, как только другие молекулярные системы дадут соответствующую «команду» (о возможной природе таких команд говорилось в заметке «Нужны ли эмбрионам гены?»).
На чем основана повышенная готовность? Авторы показали, что в местах прикрепления Pou5f1 на хромосомах клеток эмбриона перед МЗП часто встречается готовая к работе РНК-полимераза II (см.RNA polymerase II) — фермент, отвечающий за транскрипцию белок-кодирующих генов. Возможно, Pou5f1 захватывает полимеразу и держит ее наготове: понятно, что ген может быть активирован более оперативно, если на нём уже сидит готовая к работе РНК-полимераза. Кроме того, оказалось, что возле мест прикрепления Pou5f1 повышена частота встречаемости особой эпигенетической метки (H3K4me3 — триметилированный 4-й лизин гистона H3). Такие метки, как известно, влияют на активность генов (см.:Рыбки Danio rerio наследуют модификации ДНК от отца., «Элементы», 21.06.2013).
Рис. 2. Схема работы системы стабилизации МЗП. До начала МЗП (pre-MBT; MBT = midblastula tranzition, так по традиции называют МЗП у рыб) белок Pou5f1 прикрепляется к своим сайтам связывания (SOX-POU site) по соседству с ранними эмбриональными генами (priming). К началу МЗП (MBT) Pou5f1 привлекает к этим генам РНК-полимеразу II (RNA Pol II), что позволяет быстро их активировать (activation). После МЗП (post-MBT) начинается дифференцировка клеток: эмбриональные клетки начинают развиваться разными путями (lineage I, lineage II) в зависимости от получаемых сигналов (signals from patterning morphogens). На этом этапе Pou5f1, как правило, работает в комплексе с Sox2 или другими белками из группы SoxB1 и взаимодействует с тканеспецифичными регуляторами транскрипции (Tissue specific TF), помогая им делать свою работу быстро и своевременно. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science
Таким образом, исследование показало, что специальные молекулярные системы, повышающие слаженность и стабильность (robustness) материнско-зиготического перехода, есть не только у насекомых, но и у позвоночных. Функция поддержания плюрипотентности ЭСК у млекопитающих, скорее всего, вторична. Исходной и главной функцией белка Pou5f1 у позвоночных является стабилизация МЗП. У млекопитающих, в отличие от других позвоночных, МЗП происходит очень рано — на стадии двух бластомеров, то есть задолго до начала дифференцировки клеток. Может быть, тот факт, что Pou5f1 у млекопитающих поддерживает ЭСК в плюрипотентном состоянии, является просто побочным следствием сдвига МЗП на более ранние стадии развития. Рыбам не нужно долго поддерживать это состояние у эмбриональных клеток, потому что клетки начинают дифференцироваться сразу после включения генома эмбриона.
Крайне интересен тот факт, что у насекомых и позвоночных системы стабилизации МЗП основаны на разных, неродственных белках (Zelda у насекомых, Pou5f1 у позвоночных). Возможно, это означает, что такие системы возникали в ходе эволюции независимо на разной молекулярной основе. Логично предположить, что они нужнее всего сложно устроенным животным с большим числом типов клеток и тканей, таким как членистоногие и позвоночные. Ведь чем больше типов клеток, тем сложнее должна быть программа их дифференцировки и тем опаснее несинхронность и хаос в работе генно-регуляторных сетей.
Важнейшим переломным моментом является «переход от материнского типа экспрессии генов к зиготическому» (МЗП), в ходе которого в клетках эмбриона одновременно включаются десятки генов-регуляторов, которые берут на себя управление дальнейшим развитием. Германские ученые показали, что у рыбки данио-рерио переход с «материнской» программы развития на «зиготическую» управляется белком Pou5f1. Ранее про него было известно, что он работает в эмбриональных стволовых клетках млекопитающих, поддерживая их плюрипотентность (способность превращаться в специализированные клетки различных типов). Как выяснилось, Pou5f1 заранее (еще до МЗП) прикрепляется к регуляторным участкам множества генов — регуляторов развития, поддерживая их в состоянии «боевой готовности», благодаря чему они могут быстро включиться, как только будут получены соответствующие команды от других регуляторных белков или РНК. У насекомых аналогичную функцию выполняет другой, неродственный белок — Zelda. По-видимому, специальные регуляторные системы, способствующие минимизации хаоса в ходе МЗП, развивались у разных животных на разной молекулярной основе.